聚乳酸蛋白酶促降解及微生物降解綜述

馮 娟 李冠鋒 蔣全吉 祝思瑜

（臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318020）

0 引言

當(dāng)今，石油的短缺和“白色污染”日益嚴(yán)重，人們對(duì)環(huán)境的保護(hù)意識(shí)逐漸增強(qiáng)。20 世紀(jì)以來，人們一直以來致力于生物可降解塑料的研究。其中，聚乳酸是以乳酸為原料，通過聚合反應(yīng)得到的一種線型熱塑性生物可降解的脂肪族聚酯[1]，在微生物環(huán)境中可以被完全水解為CO2和H2O，被認(rèn)為是替代石化基聚合物最有前景的生物降解塑料。生物可降解塑料聚乳酸的合成可以上溯至1932年，Carothers 等采用丙交酯開環(huán)聚合法首次合成了PLA。1954年，杜邦公司進(jìn)一步研發(fā)了高分子量PLA 聚合物，并獲得專利。由于原料具有可循環(huán)再生性、反復(fù)熱加工性、生物相容性、無毒性等優(yōu)點(diǎn)， 被廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)、 包裝材料、農(nóng)業(yè)、防治等領(lǐng)域。最近幾年對(duì)聚乳酸的性能改良研究很多，PLA 產(chǎn)品的性能顯著提高， 生產(chǎn)成本不斷地降低，其應(yīng)用方面逐漸由高端的醫(yī)療領(lǐng)域，應(yīng)用到電子領(lǐng)域、一次性用品等領(lǐng)域。聚乳酸是一種新型的高分子聚合物，不溶于水、乙醇，可溶于二氯甲烷(DCM)、丙酮等。

國內(nèi)外有很多研究表明， 聚乳酸在自然條件下，微生物對(duì)聚乳酸的降解起到關(guān)鍵作用。在微生物環(huán)境中，由于環(huán)境因素如pH、溫度、濕度、營養(yǎng)等因素的不同對(duì)微生物種群和不同微生物的活性具有不同的影響，不同環(huán)境的微生物對(duì)PLA 降解具有不同的作用。PLA 雖然在自然環(huán)境下可徹底降解，但在自然環(huán)境中降解速率比較緩慢，因此，如何利用微生物提高聚乳酸的降解速率和篩選有用的降解微生物成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。本文主要對(duì)微生物降解聚乳酸的作用機(jī)理及降解微生物篩選的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和概述，并在此基礎(chǔ)對(duì)其生物降解的發(fā)展形勢做出展望。

1 P LA 蛋白酶促降降解機(jī)理

有機(jī)分子經(jīng)過生物氧化或其他的生物轉(zhuǎn)化而變成更小的分子的過程叫作生物降解或生化降解，有機(jī)物的生物降解具有重大環(huán)境意義。由于微生物有著繁多的種類和較快的代謝速率，所以微生物在生物降解過程中扮演著重要的角色。聚乳酸的降解可以分為水解、光降解、微生物降解和酶催化降解。微生物在降解聚乳酸材料中起到非常重要的作用。PLA 被微生物降解過程可以概括為： 有些微生物可以分泌胞外解聚酶， 擴(kuò)散進(jìn)入聚乳酸無定形或者較少有序的區(qū)域，逐漸降解PLA 的結(jié)晶區(qū)域。解聚酶的降解，使PLA 分子酯健斷裂，產(chǎn)生寡聚體、二聚體和單體。因?yàn)榻到猱a(chǎn)物非常小，可以通過半透性細(xì)菌膜，被作為碳源和能源被吸收和利用，最終分解成二氧化碳和水[2]。

在自然降解環(huán)境下聚乳酸本身不容易被微生物、酶等直接降解，生物降解之前，一般需先水解[3]。 PLA吸水后，其大分子主鏈中的酯鍵先水解斷裂。相對(duì)分子質(zhì)量降低，分子骨架有所破裂，形成相對(duì)分子質(zhì)量較低的組分。一般情況下，聚乳酸水解到一定程度，方可在酶的作用下繼續(xù)新陳代謝，完成降解。微生物蛋白酶和脂肪酶具有降解PLA 能力。但研究表明，唯一能使聚乳酸酯不經(jīng)水解而直接發(fā)生作用的只有蛋白酶K。1981年，利物浦大學(xué)威廉姆斯D、F.提出蛋白酶K 對(duì)聚乳酸的酶促降解作用。 之后更多的研究表明，蛋白酶K 對(duì)聚乳酸的降解起到關(guān)鍵作用。很多聚乳酸降解酶屬于蛋白酶組。蛋白酶能降解聚乳酸是因?yàn)橹饕到獾木廴樗岬摩?酯鍵。PLA 降解微生物產(chǎn)生的酶主要是蛋白酶（絲氨酸蛋白酶），少數(shù)是脂肪酶（酯酶）和角質(zhì)酶。絲氨酸蛋白酶是聚乳酸降解蛋白酶（如蛋白酶K、a-糜蛋白酶、枯草桿菌素、胰蛋白酶和蛋白酶）的主要成員。蛋白酶K 降解PLA 的機(jī)理分為四個(gè)階段：（1）底物結(jié)合；（2）親核攻擊；（3）質(zhì)子化；（4）酯水解。 蛋白酶K 序列中的主要?dú)埢鶠镾er329、His174和Asp144。 起初絲氨酸殘基被周邊絲氨酸殘基鏈激活， 激活的羰基通過親核催化與酯鍵反應(yīng)使酯鍵斷裂，PLLA 中的碳被絲氨酸酯化，并且裂解PLLA+的O-末端成為自由狀態(tài)， 水取代了裂解的PLLA+的O-末端，形成了具有正常羧基的乳酸產(chǎn)物和絲氨酸羥基[5]。

2 P LA 微生物降解

1997年，Pranamuda[6]首次報(bào)告關(guān)于PLA 降解菌的篩選，該菌命名為Amycolatopsis HT-32，在14 天的液體培養(yǎng)中， 可使得60%的聚乳酸薄膜發(fā)生降解。這也是關(guān)于PLA 降解菌株的首次報(bào)道。 國內(nèi)外報(bào)道的PLA 降解菌主要有威威達(dá)湖倫茨氏菌、 甘蔗蘭希氏菌、 芽孢桿菌、寡養(yǎng)單胞菌及真菌放線菌等，但普遍存在降解率低的問題， 菌株對(duì)pH 的耐受范圍有限的缺陷。鄭霞等[7]人研究表明PLA 在土壤中的自然降解效率較低，12 個(gè)月后，PLA 試件質(zhì)量損失率僅達(dá)到0.23%，PLA 重均分子量降低了15.3%，PLA 試件的沖擊強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度分別降低了17.4%和17.2%。林娟等[8]從垃圾填埋場取土樣，以明膠為唯一碳源，篩選到一株為L.waywayandensis 具有降解聚乳酸能力的微生物，經(jīng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)25 天后，聚乳酸失重可達(dá)84.8%。此外，該研究表明，蛋白酶在降解聚乳酸過程中，發(fā)揮了很大的作用。范森[9]等人通過對(duì)通過對(duì)沼澤地、芒果林地、稻田3 種不同土壤菌群結(jié)構(gòu)的分析，得出PLA 材料生物降解率分別為13.7%、10.6%和4.5%。同行得出，Proteobacteria 和Bacteroidetes，是降解聚乳酸材料的優(yōu)勢菌群。賈昊等[10]人，從山東濰坊使用聚乳酸/聚己二酸-對(duì)苯二甲酸丁二酯共混物（PLA/PBAT）地膜土壤中，采用以聚乳酸（PLA）為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)養(yǎng)基篩選PLA 降解菌。 從土壤中篩選獲得了一株產(chǎn)蛋白酶的 PLA 降解菌Pseudomonas mendocina，經(jīng)過條件優(yōu)化，該P(yáng)LA 降解菌產(chǎn)蛋白酶可催化降解PLA 的酯鍵，5d 內(nèi)PLA 降解率可達(dá)29.35%。該菌被保藏中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），并申請(qǐng)發(fā)明專利進(jìn)行保護(hù)。

P.Sriyapai，T 等[11]從泰國的垃圾填埋場收集了17 個(gè)土壤樣本進(jìn)行PLA 聚酯降解菌的篩選，Actinomadura sp.TF1、Streptomyces sp.APL3 在pH6.0 ～8.0 和 溫 度40～60℃之間表現(xiàn)出最高的解聚酶活性。 菌株TF1 和APL3 組成解聚酶的氨基酸具有高度保守性五肽催化三聯(lián)體（Gly-His-Ser-Met-Gly），已被證明是酯酶脂肪酶 的 一 部 分。Titiporn Panyachanakul 等[12]將Actinomadura keratinilytica strain T16-1 培養(yǎng)在5L 的發(fā)酵罐中，控制pH 為8.0，等條件，培養(yǎng)72 h，結(jié)果表明，產(chǎn)生的乳酸效價(jià)為16651 mg/L，降解率為89%。然而，PLA 降解過程中產(chǎn)生了乳酸作為降解聚乳酸的抑制劑， 該實(shí)驗(yàn)用透析方法降低發(fā)酵液中的乳酸濃度。 用透析袋進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得了PLA 降解率為99.93%，而未透析組的聚乳酸降解率約14.75%。用透析方法協(xié)同發(fā)酵的方法效率提高約6 倍。這也是第一篇關(guān)于聚乳酸在5 L 生物反應(yīng)器中放大培養(yǎng)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。同時(shí)，該論文也表明，現(xiàn)在對(duì)于聚乳酸的微生物降解工藝研究的并不是很多，評(píng)估提高聚乳酸降解效率的潛在方法。

3 結(jié)語

聚乳酸作為傳統(tǒng)不可降解材料的替代品，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如高通量測序等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)聚乳酸降解的微生物群落研究更為廣泛。影響聚乳酸降解的因素有很多，比如高效的篩選菌種方法的建立、聚乳酸降解微生物堆肥方法等、明膠、酪蛋白等物質(zhì)的誘導(dǎo)作用、高效降解酶的提取及應(yīng)用、工藝條件如溫度與PH 等條件控制。聚乳酸研究發(fā)展趨勢為: 微生物降解聚乳酸的機(jī)理將得到更廣泛的研究；篩選降解聚乳酸微生物的方法越來越多與技術(shù)將越來越成熟；逐漸從傳統(tǒng)方法篩選和育菌模式轉(zhuǎn)為更為先進(jìn)的分子技術(shù)； 將不斷地完善其降解方法與條件，能在自然狀態(tài)下，聚乳酸相關(guān)產(chǎn)量將被相關(guān)微生物及生物制品高效、快速、安全地降解[13]。

如何獲得一株高效及應(yīng)用性強(qiáng)的微生物或?qū)で蟮骄哂懈咝Ы到饽芰Φ拿?，仍然是現(xiàn)在從事該研究的主要方向。

然而，有些實(shí)驗(yàn)室能夠篩選到具有一定降解聚乳酸能力的微生物，但是對(duì)于聚乳酸降解的工藝流程與現(xiàn)實(shí)應(yīng)用鮮為報(bào)告。目前，國內(nèi)外尚無可行可靠的具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值的降解PLA 微生物或相關(guān)生物制劑的開發(fā)與投入。因此，該課題的研究具有一定的環(huán)保價(jià)值、經(jīng)濟(jì)效益和研究價(jià)值。