地涌金蓮MlCYP734A6基因的克隆與表達(dá)分析

安 靜，萬友名，馬 宏，劉雄芳，張秀姣，曹毓蓉，李正紅

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224)

油菜素甾醇（BRs）是一類在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的甾醇類化合物的總稱，作為植物的第六大內(nèi)源激素，BRs廣泛存在于低等和高等植物中，尤其是被子植物中，而且存在于植物的各個(gè)組織器官中[1-2]。目前，從自然界分離鑒定出的BRs已經(jīng)超過了70種，其中，被認(rèn)為分布最廣泛且活性最強(qiáng)的是油菜素內(nèi)酯（BL），通常被人們用來指代BRs[3-4]。BRs在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，尤其調(diào)控著許多重要的農(nóng)藝性狀，如植物結(jié)構(gòu)、開花時(shí)間、種子產(chǎn)量和抗逆性等[5-8]。微劑量的BRs就可以顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但過量的BRs則抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，維持和調(diào)節(jié)內(nèi)源BRs水平對(duì)植物的最佳生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)至關(guān)重要[9]。植物的生長(zhǎng)發(fā)育主要受環(huán)境因素和各種植物激素的調(diào)控，已有多篇文獻(xiàn)證明油菜素內(nèi)酯與不同的植物激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸、多胺、水楊酸等相互作用，引發(fā)植物代謝及其生長(zhǎng)發(fā)育的各種反應(yīng)[10]。對(duì)BRs的研究近10多年一直呈逐年上升的態(tài)勢(shì)[11]。

由于BRs不能進(jìn)行組織和器官間的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，所以BRs的生物合成和分解代謝是維持BRs在植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)含量的兩個(gè)關(guān)鍵拮抗過程[12-13]。目前，幾乎完整的BRs生物合成及代謝途徑已經(jīng)被解析出來[14-16]。BRs代謝通路上最關(guān)鍵的失活基因CYP734As已經(jīng)在多種植物中被挖掘及研究[17-22]。CYP734As基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450酶家族，在BRs失活過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可以催化BL和栗甾酮（CS）的C26位置上發(fā)生羥基化，使BRs失活，從而下調(diào)植物體內(nèi)活性BRs水平[8,23]。BAS1/CYP734A1是第一個(gè)被研究報(bào)道出來對(duì)BRs失活有明確羥基化作用的基因，在擬南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）中過表達(dá)AtCYP734A1可導(dǎo)致植物體內(nèi)BRs含量下降，植株出現(xiàn)極度矮化、葉片緊縮的表型[17]。而后，該基因的同源基因在其他植物中被陸續(xù)研究報(bào)道，番茄（Solanum lycopersicumMill）中 的CYP734A7、棉 花（Gossypium hirsutumL.）中的PAG1、胡蘿卜（Daucus carotaL.）中的DcBAS1以及水稻（Oryza sativaL.）中的CYP734As，都被研究證實(shí)了具有使BRs失活的功能[18-20,22]。內(nèi)源活性BRs具有反饋機(jī)制，當(dāng)含量多時(shí)會(huì)下調(diào)合成基因和上調(diào)代謝基因，CYP734As的上調(diào)表達(dá)通常是由于BRs的反饋調(diào)控引起的[24]。CYP734As基因還受到其他影響因子的正負(fù)調(diào)控，有報(bào)道稱，BAS1基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子BZR1和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF7的反向調(diào)控，二者都與BAS1啟動(dòng)子中的相同motifs結(jié)合，ARF7可抑制BAS1的表達(dá)或促進(jìn)BRs生物合成基因DWF4的表達(dá)，來增加內(nèi)源性BRs含量[25]。

地涌金蓮（Musella lasiocarpa(Franchet) C. Y.Wu ex H. W. Li.）是中國金沙江河谷流域的特有珍稀單種屬植物，屬于芭蕉科（Musoideae）地涌金蓮屬（Musella），具有優(yōu)美奇特的蓮座狀花序及端正筆挺的株形，文化及觀賞價(jià)值極高。本研究組率先找到了幾處地涌金蓮野生種群，從中發(fā)現(xiàn)了株高、苞片顏色、吸芽數(shù)量等性狀的不同變異類型，并注冊(cè)登記了5個(gè)地涌金蓮新品種[26-27]。筆者從前期高桿和矮桿2個(gè)無性系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，與BRs代謝相關(guān)的CYP734A6基因的表達(dá)水平在矮桿品系中顯著高于高桿品系，由此推測(cè)，地涌金蓮植株高矮性狀可能與CYP734A6基因的差異表達(dá)導(dǎo)致BRs含量不同相關(guān)。為進(jìn)一步探究地涌金蓮中CYP734A6基因的相關(guān)信息及表達(dá)規(guī)律，本研究克隆得到了MlCYP734A6基因的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析，同時(shí)應(yīng)用qRT-PCR分析了MlCYP734A6基因在不同地涌金蓮類型及不同組織部位中的表達(dá)模式，并與油菜素內(nèi)酯含量做了相關(guān)性分析，以期為探究MlCYP734A6基因在地涌金蓮生長(zhǎng)發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供分子依據(jù)，對(duì)今后采用分子手段培育不同株形性狀新品種也具參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料種植于中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所位于云南省祿豐縣的滇中高原試驗(yàn)站。以地涌金蓮矮桿類型（RD05）和高桿類型（YN01）為試驗(yàn)材料，二者均為來自于單株的組培苗無性系。2019年5月，從定植3 a的2個(gè)無性系中各隨機(jī)選擇30株調(diào)查平均株高，測(cè)量數(shù)據(jù)（RD05: 21.50 ±4.31 cm, YN01: 54.74 ± 6.06 cm）顯示二者存在極顯著差異（p＜ 0.01）；各隨機(jī)選擇3株長(zhǎng)勢(shì)健壯的初花期植株，分別取每株的苞片、花序軸（假莖中間的莖稈）、葉、吸芽芽點(diǎn)及根尖5個(gè)部位為樣品，每個(gè)部位至少3 g，采集的樣品立即放入液氮中，隨后保存于-80°C冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 采用CTAB法[28]提取地涌金蓮樣品總RNA；采用1.0%瓊脂凝膠電泳和NanoDrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量；按照Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒VRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書中的步驟合成cDNA第一鏈。

1.2.2MlCYP734A6基因的克隆 根據(jù)本研究組前期地涌金蓮轉(zhuǎn)錄組信息（材料來源與本研究相同），在油菜素內(nèi)酯代謝通路上篩選到1個(gè)注釋為CYP734A6的顯著差異基因片段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2條特異性擴(kuò)增引物QA029F2和QA029R1（表1）。以RD05的5個(gè)部位材料等量混合提取RNA后反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：2 × PCR Buffer for KOD FX Neo 25.0 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL，KOD FX Neo (1 U·μL-1)1.0 μL，cDNA第一鏈5.0 μL，ddH2O 15.0 μL，正反引物各1.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)合格，回收目的條帶，使用TaKaRa公司的T4連接酶試劑盒進(jìn)行連接后，4℃過夜，采用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得陽性克隆后交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3MlCYP734A6基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用NCBI網(wǎng)站中的ORF finder和CDD功能查找克隆獲得的全長(zhǎng)序列的開放閱讀框和保守結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用Expasy網(wǎng)站（https://www.expasy.org/）中的ProtParam和Protscale在線軟件分析蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性；應(yīng)用DTU.dk網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu.dk/）中的SignaIP5.0、NetPhos3.1和TMHMM2.0在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)；使用BUSCA（http://busca.biocomp.unibo.it/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位和蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型；應(yīng)用DNAMAN8.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；應(yīng)用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以上在線分析軟件的設(shè)置系數(shù)皆為系統(tǒng)默認(rèn)值。

1.2.4MlCYP734A6基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析 根據(jù)地涌金蓮MlCYP734A6基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)出1對(duì)熒光定量特異性引物AJ17F和AJ17R，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為146 bp，以地涌金蓮TUBA為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物TUBAF和TUBAR，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為190 bp（表1）。分別以地涌金蓮RD05和YN01的苞片、花序軸、葉、吸芽芽點(diǎn)及根尖部位的cDNA為模板，對(duì)MlCYP734A6進(jìn)行定量表達(dá)分析。儀器為BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，采用Power SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems?Cat: 4 367 659)試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0℃預(yù)變性3 min；95.0℃ 10 s，55.0℃ 20 s，72.0℃ 20 s，75.0℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用SPSS軟件中的ANONA模塊進(jìn)行Duncan多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析。

1.2.5 油菜素內(nèi)酯的提取與檢測(cè) 取地涌金蓮RD05和YN01各3株的苞片、花序軸、葉、吸芽芽點(diǎn)及根尖5個(gè)部位為油菜素內(nèi)酯檢測(cè)材料，每個(gè)部位至少3 g，交由南京卡文思檢測(cè)技術(shù)有限公司采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（HPLC-MS/MS）進(jìn)行BL含量測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。檢測(cè)濃度帶入公式：BL含量（ng·g-1）= 檢測(cè)濃度（ng·mL-1）× 體積系數(shù)（mL）/質(zhì)量系數(shù)（g），式中體積系數(shù)為0.20 mL，質(zhì)量系數(shù)為樣品實(shí)際稱取質(zhì)量。應(yīng)用SPSS軟件中的雙變量相關(guān)性計(jì)算方法，計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)r值和顯著性P值，對(duì)MlCYP734A6及油菜素內(nèi)酯含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地涌金蓮MlCYP734A6基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以地涌金蓮RD05的cDNA為模版，應(yīng)用特異性引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示：在位于1 000～2 000 bp間有1條與預(yù)期大小相符的條帶，經(jīng)回收、測(cè)序后，顯示該片段實(shí)際大小為1 639 bp（圖1）。結(jié)合3′和5′ RACE技術(shù)，拼接出地涌金蓮CYP734A6的基因序列全長(zhǎng)，命名為MlCYP734A6（GenBank登錄號(hào)MW013148）。該基因全長(zhǎng)為1 936 bp，其中，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)度為131 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)度為221 bp，包括長(zhǎng)度為118 bp的polyA尾巴（圖2）。

圖1 MlCYP734A6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of MlCYP734A6

圖2 地涌金蓮MlCYP734A6基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and amino acid sequence coded of MlCYP734A6

MlCYP734A6包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 584 bp的完整開放閱讀框，編碼527個(gè)氨基酸，存在1個(gè)細(xì)胞色素P450蛋白家族結(jié)構(gòu)域。TMHMM在線預(yù)測(cè)該蛋白在7～29氨基酸殘基位置存有1個(gè)螺旋跨膜區(qū)域；SignalP5.0在線預(yù)測(cè)無信號(hào)肽位點(diǎn)，屬于非分泌性蛋白質(zhì)；BUSCA在線預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白包含51.04%的α-螺旋、12.14%的延長(zhǎng)鏈、5.31%的β-折疊和31.50%的無規(guī)則卷曲（圖3）。理化性質(zhì)分析結(jié)果推測(cè)出，MlCYP734A6蛋白的分子式為C2728H4287N751O737S20，相對(duì)分子量為60 038.84 Da，等電點(diǎn)為9.44，酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為54，堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為67，穩(wěn)定性系數(shù)為44.32，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為94.00；Protscale在線分析結(jié)果顯示，總平均親水性（GRAVY）為-0.111，推測(cè)MlCYP734A6為親水性蛋白(圖4A)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，磷酸化位點(diǎn)有40處，其中，絲氨酸19處、蘇氨酸17處、絡(luò)氨酸4處（圖4B）。

圖3 MlCYP734A6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary structure prediction of MlCYP734A6

圖4 MlCYP734A6的親/疏水性分析和磷酸化位點(diǎn)分析Fig.4 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis and phosphorylation sites analysis of MlCYP734A6

2.2 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將地涌金蓮MlCYP734A6編碼的氨基酸序列與其他植物進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與多種植物的相似性達(dá)到75%以上，其中，與小果野蕉亞種（Musa acuminatasubsp.malaccensis）的相似性最高，達(dá)到94.69%，其次是鳳梨（Ananas comosus(L.) Merr.）和油棕（Elaeis guineensisJacq.），分別為73.66%和73.33%。應(yīng)用DNAMAN8.0軟件將MlCYP734A6氨基酸序列與相似度比較高的幾種植物進(jìn)行比對(duì)分析，顯示這幾種植物均存在1個(gè)結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞色素P450蛋白家族結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖5 地涌金蓮與其他植物的CYP734A6氨基酸序列比對(duì)Fig.5 The alignment of amino acid sequences of CYP734A6 in M. lasiocarpa and other plants

為了分析CYP734A6在不同植物間的親緣關(guān)系，應(yīng)用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-joining方法將地涌金蓮MlCYP734A6與其他14種植物的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，聚類結(jié)果顯示，地涌金蓮MlCYP734A6與小果野蕉亞種和油棕的同源蛋白遺傳關(guān)系最近，而與黍（Panicum halliVasey.）、谷子（Setaria italica(L.) Beauv.）等單子葉植物遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 地涌金蓮MlCYP734A6與其同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of MlCYP734A6 of M. lasiocarpa and itshomologous

2.3 MlCYP734A6基因的表達(dá)模式分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MlCYP734A6基因在不同地涌金蓮類型和不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖7）表明：MlCYP734A6基因在2種類型地涌金蓮的所有組織中均有表達(dá)且相對(duì)表達(dá)量差異顯著（p＜ 0.05），矮桿類型地涌金蓮RD05的花序軸中MlCYP734A6的相對(duì)表達(dá)量最高，為15.722，其次是根尖、苞片和吸芽芽點(diǎn)，最低的部位是葉片，僅為0.907；高桿類型YN01中，根尖中的相對(duì)表達(dá)量最高，為2.589，其次是苞片、花序軸、芽點(diǎn)，最低的部位也是葉片，僅為0.444。2種類型地涌金蓮?fù)唤M織部位的比較分析結(jié)果顯示，RD05在各個(gè)組織部位的相對(duì)表達(dá)量皆高于YN01，RD05的花序軸、根尖、苞片、吸芽芽點(diǎn)和葉片的相對(duì)表達(dá)量分別是YN01的14.13、5.08、4.47、1.28、2.04倍。

圖7 MlCYP734A6在不同類型地涌金蓮各組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of MlCYP734A6in different tissuesof M. lasiocarpa

2.4 油菜素內(nèi)酯含量測(cè)定及與MlCYP734A6基因表達(dá)量水平的相關(guān)性分析

為了分析MlCYP734A6表達(dá)水平與油菜素內(nèi)酯含量的相關(guān)性及地涌金蓮株高與油菜素內(nèi)酯的關(guān)系，筆者采用HPLC-MS/MS分別測(cè)定了2個(gè)類型地涌金蓮5個(gè)組織部位的BL含量，檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示：地涌金蓮的5個(gè)組織部位皆能檢測(cè)出BL，但不同組織中BL含量差異顯著。在YN01中，葉片中的BL含量最高，為0.032 ng·g-1，其次是根尖、芽點(diǎn)、苞片和花序軸，分別是0.014、0.009、0.006、0.003 ng·g-1；在RD05中，苞片中的BL含量最高，為0.067 ng·g-1，其次是花序軸、芽點(diǎn)、葉片和根尖，分別是0.056、0.035、0.008、0.007 ng·g-1。結(jié)合MlCYP734A6的表達(dá)模式分析，YN01中的MlCYP734A6基因在葉中的表達(dá)水平最低，但BL含量卻最高，而MlCYP734A6在花序軸的表達(dá)量較高，但BL含量卻最低；在RD05中，花序軸中MlCYP734A6表達(dá)水平最高，但BL含量也較高，葉片中MlCYP734A6表達(dá)水平最低，BL含量也非常低。通過SPSS軟件對(duì)不同組織中MlCYP734A6基因表達(dá)水平和BL的相關(guān)性進(jìn)行分析，計(jì)算結(jié)果（YN01:r值0.568，p值0.318；RD05:r值-0.212，p值0.732）顯示，二者之間不存在顯著相關(guān)性。

圖8 不同類型地涌金蓮不同組織中的BL含量Fig.8 The content of BL in different tissues of M. lasiocarpa

3 討論

本研究成功地從地涌金蓮中克隆到1個(gè)油菜素內(nèi)酯代謝通路上的失活基因MlCYP734A6，通過多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示該基因編碼的MlCYP734A6蛋白與同為芭蕉科的小果野蕉亞種的同源蛋白具有94.69%的高相似性，并且與其他植物的CYP734As進(jìn)行比對(duì)，顯示都具有細(xì)胞色素P450蛋白家族結(jié)構(gòu)域，說明CYP734As在生物演變過程中是高度保守的，即MlCYP734A6可能具有與其他CYP734As類似的使BRs羥基化的功能。

對(duì)地涌金蓮MlCYP734A6基因在不同株高類型地涌金蓮中的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，MlCYP734A6在地涌金蓮不同組織部位的表達(dá)水平差異顯著，2種類型地涌金蓮分別在花序軸和根尖中的表達(dá)水平最高，這一結(jié)果與馬鈴薯StCYP734A1和水稻CYP734A6的表達(dá)模式類似，StCYP734A1在馬鈴薯的根中的表達(dá)水平最高，其次是莖，而水稻CYP734A6也是在莖節(jié)中的表達(dá)水平最高[21,29]。MlCYP734A6在地涌金蓮中的這種表達(dá)模式與棉花中的PAG1基因的表達(dá)模式相反，在地涌金蓮中，MlCYP734A6在花序軸和根尖中的表達(dá)水平最高，而在葉中的表達(dá)水平最低，而在棉花中，PAG1在根部和莖部的表達(dá)水平最低，在葉片中的表達(dá)水平最高[18]。由此可見，CYP734As基因在不同植物中的表達(dá)模式不盡相同，可能是由于BRs在不同植物的不同組織器官中行使著不同的功能，所以導(dǎo)致調(diào)控BRs含量的代謝基因CYP734As的表達(dá)模式差異很大。

分析HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果可知，BL在地涌金蓮各個(gè)組織器官中均可檢測(cè)到，且含量差異顯著，但與MlCYP734A6表達(dá)水平無顯著相關(guān)性。在YN01中，葉中的MlCYP734A6表達(dá)水平最低，而BL含量卻最高，花序軸中MlCYP734A6的表達(dá)水平較高，而BL含量卻最低，說明MlCYP734A6可能在YN01的花序軸的BRs代謝通路上起到重要的代謝調(diào)控作用，主效下調(diào)著BRs含量的積累；而在RD05中，苞片中的BL含量最高，而MlCYP734A6的表達(dá)水平有也較高，是YN01的14.13倍，推測(cè)苞片中BRs合成基因的表達(dá)水平可能比較高，與代謝基因MlCYP734A6共同調(diào)控著BRs含量水平，而且MlCYP734A6在RD05中的高表達(dá)水平可能也受到了高含量BRs的反饋上調(diào)調(diào)控[24]。

高桿類型YN01的平均株高是矮桿類型RD05的2.57倍，結(jié)合地涌金蓮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，前期分析篩選出BRs生物合成代謝途徑中有3個(gè)顯著差異Unigene，分別注釋為合成通路中的CYP90A1/CPD、CYP90B1/DWF4和代謝通路中的CYP734A6，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中沒有顯著差異基因，這3個(gè)Unigene均是在RD05中顯著上調(diào)，其中，CYP734A6基因的表達(dá)量最高，顯著差異性最大，結(jié)合RD05的矮桿表型，故初期推測(cè)RD05中的BL含量應(yīng)較低，但HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果與前期預(yù)測(cè)不符，檢測(cè)結(jié)果顯示，RD05花序軸中的BL含量是YN01的18.67倍。推測(cè)可能的原因是，雖然RD05中的代謝基因CYP734A6顯著上調(diào)，可使BRs含量下降，但合成通路中2個(gè)合成基因的顯著上調(diào)發(fā)揮更大的調(diào)控作用，導(dǎo)致合成量高于代謝量，在花序軸中積累了過量的BRs。由于BRs具有雙向調(diào)控的功能，缺乏或過量都會(huì)抑制植株生長(zhǎng)，但目前對(duì)于過量BRs抑制植物生長(zhǎng)的分子機(jī)理還尚未解析[29]，所以推測(cè)地涌金蓮RD05的矮化表型，可能是由于過量的內(nèi)源BRs所致。植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中，激素間的協(xié)同互作發(fā)揮著重要作用[30-31]。當(dāng)BRs含量較高時(shí)，可抑制赤霉素的合成，從而抑制植物生長(zhǎng)[29]。ABA作為植物生長(zhǎng)抑制激素，雖然BRs在某些植物生理反應(yīng)的調(diào)控中與ABA存在拮抗關(guān)系，但當(dāng)BRs含量升高時(shí)，可上調(diào)若干個(gè)ABA響應(yīng)基因和ABA生物合成基因[32]。故不排除其他激素對(duì)地涌金蓮株高上的影響。所以接下來可以對(duì)不同類型地涌金蓮在不同生長(zhǎng)階段進(jìn)行全激素含量檢測(cè)分析，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行激素和調(diào)控基因間的交互分析，為后續(xù)利用分子生物學(xué)技術(shù)改良地涌金蓮株形提供參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了地涌金蓮MlCYP734A6基因，并分析了其編碼蛋白的序列結(jié)構(gòu)及蛋白特性，明確了MlCYP734A6在地涌金蓮中的表達(dá)模式，分析了油菜素內(nèi)酯與株高的關(guān)系。本研究結(jié)果為后續(xù)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因或RNAi技術(shù)等調(diào)控MlCYP734A6的表達(dá)來平衡地涌金蓮中油菜素內(nèi)酯含量，進(jìn)而為地涌金蓮的生長(zhǎng)發(fā)育水平奠定了分子基礎(chǔ)，也為研究CYP734As在其他植物中的調(diào)控作用提供理論數(shù)據(jù)。