雜交構(gòu)樹(shù)根際固氮菌的分離與特性研究

張 軍，彭軼楠，郭 琪，王沛雅，李 鑫，楊 暉

(甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“特色微生物與植物資源創(chuàng)新”甘肅省國(guó)際科技合作基地，甘肅 蘭州 730000)

構(gòu) 樹(shù) (Broussonetia papyrifera(Linnaeus) L’Héritier ex Ventenat)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生喬木，屬于桑科（Moraceae）構(gòu)屬(Broussonetia)。根據(jù)Angiosperm Phylogeny Group III分類(lèi)系統(tǒng)，又屬固氮分支[1]。近年來(lái)，新品種雜交構(gòu)樹(shù)華構(gòu)1號(hào)因抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、粗蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)點(diǎn)，被用作優(yōu)質(zhì)的木本飼料來(lái)源在全國(guó)20多個(gè)省（市）推廣種植；但在甘肅等西北干旱與半干旱地區(qū)，雜交構(gòu)樹(shù)的生長(zhǎng)存在產(chǎn)量低、翌年返青率低等問(wèn)題[2]。針對(duì)以上問(wèn)題，研究人員一方面開(kāi)展了選育適宜甘肅冷涼地區(qū)的高產(chǎn)抗寒性品系的工作；另一方面，鑒于研究表明雜交構(gòu)樹(shù)高含量的粗蛋白來(lái)源和速生可能與其內(nèi)生和根際共生的共生固氮或聯(lián)合固氮菌有密切關(guān)系[3]，可通過(guò)從雜交構(gòu)樹(shù)根際土壤中篩選本土固氮菌微生物再回接的方式，提高菌肥效果，達(dá)到增產(chǎn)的目的。因此，根據(jù)土壤環(huán)境情況分離篩選雜交構(gòu)樹(shù)優(yōu)良固氮菌株，是研制菌肥最基礎(chǔ)的前期工作。本研究旨在從甘肅地區(qū)種植的雜交構(gòu)樹(shù)根際分離篩選獲得固氮菌株，并對(duì)其固氮、促生、溶磷、生物防治等功能進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)甘肅地區(qū)雜交構(gòu)樹(shù)微生物氮肥提供菌種資源。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品

為便于研究，將根際分為遠(yuǎn)根土(距離根部1～10 cm的土壤）、根表土（距離根部0～1 cm的土壤）與根3個(gè)部位，于2019年8月在甘肅的天水（34°5′ N，105°82′ E）、蘭州（36°0′ N，103°57′ E）和張掖（38°43′ N，100°40′ E）雜交構(gòu)樹(shù)種植試驗(yàn)區(qū)，按照蛇型采樣法，各取5個(gè)點(diǎn)分別采樣，現(xiàn)場(chǎng)混合后將根系樣品和采用四分法保留的土壤樣品裝入無(wú)菌自封袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。天水、蘭州、張掖采樣區(qū)0～20 cm土層土壤的全氮含量分別為0.616、0.356、0.284 g·kg-1，硝態(tài)氮含量分別為247.00、28.80、26.05 mg·kg-1。

1.2 供試病原菌

灰霉菌（Botrytis cinereaPersoon）（Bc）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKuhn）（Rs）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）（Fo）、腐皮鐮孢菌（Fusarium solani(Martius) Sacco）（Fs）、茄鏈格孢（Alternaria solani(Elliset G. Martin) Sorauer）（As）由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植保所提供。

2 研究方法

2.1 固氮菌的分離與培養(yǎng)

遠(yuǎn)根土與根表土固氮菌的分離采用常規(guī)稀釋平板涂布法在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行。根系固氮菌的分離：取根徑約1～10 mm的根，剪成3～5 cm的段，用自來(lái)水沖洗1～2 h，在無(wú)菌操作臺(tái)中用75%酒精浸泡1 min后，無(wú)菌水洗滌3～5次，再用0.1%的升汞浸泡3 min后，無(wú)菌水洗滌3～5次，吸干表面水分，切成5～8 mm的小段，接種于Ashby培養(yǎng)基。28℃，恒溫培養(yǎng)5～7 d，待分離的菌落長(zhǎng)出后用平板劃線(xiàn)法繼續(xù)在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。將純化好的菌株接入LB斜面上，培養(yǎng)3 d后置于冰箱4℃保藏。

2.2 固氮菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

觀察菌落形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說(shuō)明提取單菌落基因組DNA，送生物工程（上海）股份有限公司16S rDNA測(cè)序，結(jié)果與NCBI GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)后，判定細(xì)菌種類(lèi)并劃分到屬或種。應(yīng)用MEGA7.0軟件，采用鄰接法聚類(lèi)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為1 000。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

固氮酶活性按照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定；溶磷能力采用定性溶磷圈法[4]和鉬銻抗定量比色法[5]測(cè)定；分泌IAA 能力采用定性顯色法和Salkowski定量比色法[5-6]測(cè)定。

2.4 固氮菌對(duì)植物病原真菌的拮抗能力

采用濾紙條法[7]研究分離到的固氮菌對(duì)植物病原真菌的拮抗能力。用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離得到的固氮菌，待菌體濃度達(dá)到OD600= 1時(shí)，取菌液備用。在PDA培養(yǎng)基平板中央接種直徑為7 mm的植物病原菌菌絲塊，分別進(jìn)行如下3種處理：a對(duì)照（無(wú)處理）；b無(wú)菌水濾紙條對(duì)照（距菌絲塊兩側(cè)1.5 cm位置放置用無(wú)菌水浸濕的濾紙條）；c拮抗試驗(yàn)（距菌絲塊兩側(cè)1.5 cm位置放置浸濕固氮菌菌液的濾紙條）。3種處理28℃培養(yǎng)7～10 d，觀察抑菌效果。待處理b病原菌鋪滿(mǎn)整個(gè)平板時(shí)，垂直濾紙條方向測(cè)量處理b與處理c病原菌的菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率 =（處理b菌落直徑-處理c菌落直徑）/處理b菌落直徑 × 100%。

2.5 菌株特性綜合評(píng)價(jià)

采用熵權(quán)法[8]對(duì)分離到菌株性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 固氮菌菌株的分離及鑒定

經(jīng)16S rDNA測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從3個(gè)試驗(yàn)區(qū)雜交構(gòu)樹(shù)根際共分離到10株固氮菌，有5株菌為3地共有，分屬同1菌株（表1）。與該屬模式菌株及最高相似性菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）表明：10株菌分屬8個(gè)屬9個(gè)種，其中，3地共有菌HTZ1、HTZ2、HTZ3、HTZ4、HTZ5分別被認(rèn)定為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend) Conn）（同源相似性98.16%，下同）、費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii(Scholla et Elkan) Chen）(99.82%)、阿拉伯分枝桿菌（Mycolicibacterium arabienseZhang）（98.88%）、墨西哥假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas mexicanaThierry）（97.87%）和日本假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas japonensisThierry）（98.13%）。從天水試驗(yàn)區(qū)遠(yuǎn)根土中另外分離得到的2株菌TS2、TS4，分屬纖維弧菌屬（Cellvibrio）和固氮菌屬（Azotobacter），被認(rèn)定為Cellvibrio fibrivoransMergaert（98.17%）和圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcumBeijerinck）（99.73%）。從蘭州遠(yuǎn)根土和根表土中另外分離得到的2株菌HP5、HP10分屬腸桿菌屬（Enterobacter）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium），被認(rèn)定為煙草腸桿菌（Enterobacter tabaciDuan）（99.53%）和Sphingobium abikonenseKumari（98.70%）。從張掖遠(yuǎn)根土中分離得的ZY9也屬于假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonassp.）（99.38%）。以上菌株在雜交構(gòu)樹(shù)根際的分布數(shù)量表現(xiàn)為根表土 ＞ 遠(yuǎn)根土，菌株種類(lèi)數(shù)量最多的為假黃單胞菌屬，共3株，優(yōu)勢(shì)率為37.5%。3個(gè)試驗(yàn)區(qū)雜交構(gòu)樹(shù)的根內(nèi)均未分離得到固氮菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的10株雜交構(gòu)樹(shù)根際固氮菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of nitrogen fixing strains from rhizosphere constructed based on 16S rDNA gene sequence

表1 雜交構(gòu)樹(shù)根際固氮菌分離結(jié)果與菌落形態(tài)Table 1 Results and colony morphology of root-bound nitrogen-fixing bacteria from hybrid Broussonetia papyrifera

3.2 固氮、溶磷、促生、生防特性及綜合評(píng)價(jià)

表2表明：分離得到的10株固氮菌固氮酶活性存在差異，其中，HTZ4的固氮酶活性最低（130.41 IU·L-1），TS4的活性最高（184.51 IU·L-1）。所有固氮菌均無(wú)溶解無(wú)機(jī)磷的能力，僅HTZ2和TS4在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)上出現(xiàn)溶磷圈，說(shuō)明這2株菌具有一定溶解有機(jī)磷（卵磷脂）的能力（圖2、表2），但二者差異不顯著，而在發(fā)酵液中有機(jī)磷的增量表現(xiàn)為T(mén)S4顯著大于HTZ2。能夠分泌IAA的固氮菌有8株，占分離獲得菌株數(shù)量的80%。HTZ4和HTZ1產(chǎn)IAA顯色反應(yīng)最明顯，說(shuō)明具有較強(qiáng)的分泌IAA的能力，分泌量分別達(dá)44.62、36.52 μg·mL-1，與其他菌株差異極顯著；HTZ4菌液IAA的分泌量比HP10的高出約20倍（表2）。

表2 固氮菌固氮酶活性、溶磷和產(chǎn)IAA能力的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of activity, dissolved phosphorus and IAA production capacity of nitrogen-fixing bacteria

圖2 菌株HTZ2（A）和TS4（B）在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上的解磷能力Fig.2 Phosphorolysis ability of strains HTZ2（A）and TS4（B）on Montana organophosphate medium

10株固氮菌對(duì)不同植物病原菌的拮抗作用不同（表3、圖3、4）。所有菌株對(duì)Bc均無(wú)拮抗作用，除HTZ2、TS4和TS2對(duì)另外4種供試病原菌也無(wú)抑制效果或效果微弱外，其余7株菌分別對(duì)至少2種以上病原菌有一定的抑制作用，其中，HP5、HP10、HTZ4、ZY9對(duì)As、Fs、Fo均有拮抗作用，HTZ4、HP5分別對(duì)As、Fs的抑菌率最大，分別為50.00%、47.37%，其次為HP10，對(duì)As、Fs抑制率分別為45.83%、44.44%；HP5、ZY9對(duì)Rs也有拮抗作用。

圖3 HP5菌株與部分病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Antagonistic test results of the HP5 strain against some pathogenic fungi

表3 固氮菌與植物病原菌的拮抗作用Table 3 Results of antagonism between nitrogen-fixing bacteria and plant pathogenic fungi

通過(guò)對(duì)分離得到的10株固氮菌進(jìn)行固氮、溶磷、分泌生長(zhǎng)素、抑菌特性測(cè)試結(jié)果表明：各菌株對(duì)不同測(cè)試指標(biāo)表現(xiàn)各異，其中，TS4、HTZ2 具有固氮、溶磷、分泌IAA的能力，但不具備抑制供試病原菌的能力；HP5、HTZ4、HTZ5、ZY9、HP10除無(wú)溶磷能力外，具有不同程度的固氮、分泌IAA、抑制病原菌Fs、As、Fo、Rs的作用，而TS2具有較強(qiáng)的固氮能力。為此，對(duì)10株固氮菌的上述4個(gè)特性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)（表4），排名前5位的菌株為T(mén)S4、HP5、ZY9、HTZ4和HTZ5。

表4 固氮菌特性綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Comprehensive evaluation results of nitrogen-fixing bacteria characteristics

圖4 HP10菌株與部分病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Antagonistic test results of the HP10 strain against some pathogenic fungi

4 討論

聯(lián)合固氮菌不同于具有專(zhuān)一宿主植物（如豆科）的共生固氮菌（如根瘤菌），大多聚集在植物根表而在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[9]，除具有固氮能力外，還可通過(guò)分泌生長(zhǎng)激素、溶磷、增強(qiáng)抗病性和抗逆性等間接作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)[10]。目前，利用聯(lián)合固氮菌調(diào)控植物微生態(tài)環(huán)境已應(yīng)用在玉米[11]、甘蔗[12]等作物上，其生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益潛力前景廣闊。本研究對(duì)雜交構(gòu)樹(shù)根際聯(lián)合固氮菌的分離屬首次。從甘肅3個(gè)雜交構(gòu)樹(shù)種植試驗(yàn)區(qū)共分離到分屬8個(gè)屬的固氮菌，以假黃單胞菌屬居多，與通過(guò)高通量測(cè)序得出構(gòu)樹(shù)根際微生物以假單胞菌屬數(shù)量最多的結(jié)果不一致[3]，這可能與雜交構(gòu)樹(shù)生長(zhǎng)年限和取材地域的差異有關(guān)。分離得到的固氮菌菌株在根際的分布數(shù)量表現(xiàn)為根表土 ＞ 遠(yuǎn)根土 ＞ 根，這一規(guī)律與從玉米和禾草根際分離促生菌[13-14]得到的結(jié)果一致；但3地根中沒(méi)有分離到固氮菌，又與前二者能夠在根中獲得菌株不一致，這可能與各自的繁殖方式不同有關(guān)，前二者主要進(jìn)行種子繁殖，存在一定內(nèi)源微生物，雜交構(gòu)樹(shù)為無(wú)性繁殖組培苗，受微生物侵染的幾率較小，煉苗后移植大田的種植年限也較短（3地種植期均為2 a）。另外，黃酮類(lèi)化合物是雜交構(gòu)樹(shù)的主要藥用成分，也是微生物向雜交構(gòu)樹(shù)根際定殖的重要信號(hào)物質(zhì)[3]，幼齡期雜交構(gòu)樹(shù)根中黃酮類(lèi)物質(zhì)的積累明顯不足，有可能造成微生物向根表移動(dòng)而尚未侵入內(nèi)根際；但也不能排除分離方法的局限性是根內(nèi)未分離出菌株的原因之一。上述推測(cè)需后續(xù)開(kāi)展試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究中，5株3地共有菌均來(lái)自根表土，說(shuō)明離雜交構(gòu)樹(shù)根系較近土壤中的微生物種類(lèi)可能只與根中信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)有關(guān)；而3地特有種，除HP10以外均來(lái)自遠(yuǎn)根土，說(shuō)明較遠(yuǎn)土壤中的微生物種類(lèi)可能受3地氣候、土壤理化性質(zhì)、類(lèi)型及耕作措施等因素的影響較大。有研究表明，土壤含氮量是影響植物固氮菌種類(lèi)和數(shù)量的重要因素[15-16]，高水平的氮素不利于固氮菌菌群的生長(zhǎng)。本研究中，從天水試驗(yàn)區(qū)根際土壤中獲得的固氮菌種類(lèi)與數(shù)量并未因土壤中全氮和硝態(tài)氮水平與蘭州、張掖試驗(yàn)區(qū)差異較大而呈明顯差異，差異僅表現(xiàn)為特有種，可能原因是3地試驗(yàn)區(qū)土壤含氮量整體偏低而不足以產(chǎn)生“氮阻遏”效應(yīng)。雜交構(gòu)樹(shù)根部雖不形成根瘤，但從根際分離到了根瘤菌，說(shuō)明根瘤菌也可定殖于非豆科植物根際固氮[17]。

從菌株特性看，本研究中固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌能力較強(qiáng)的菌株在屬種的分布無(wú)較強(qiáng)規(guī)律性，具有一定的普遍性，且大多分離自根表土，離根系較近，表明這些菌株的活性與雜交構(gòu)樹(shù)根際分泌物的相互作用也有一定相關(guān)性[18]。本研究應(yīng)用熵權(quán)法篩選出了綜合性能較強(qiáng)的5株固氮菌，但排名靠后的菌株在某些特性方面的表現(xiàn)也較優(yōu)異，如鞘氨醇桿菌屬菌株HP10，在本研究中表現(xiàn)為較高的固氮酶活性和抑制腐皮鐮孢菌、茄鏈格孢的能力，該屬菌株在降解芳香族化合物、耐鹽堿、青貯中蛋白水解[19-21]等方面都有應(yīng)用，具有多種生物學(xué)功能。因此，可進(jìn)一步發(fā)掘其應(yīng)用范圍或研究與其他菌株的聯(lián)合應(yīng)用。另外，雜交構(gòu)樹(shù)抗逆性強(qiáng)，耐鹽堿[22]，后續(xù)可在鹽堿地種植的雜交構(gòu)樹(shù)根際發(fā)掘耐鹽、耐堿固氮菌株。

5 結(jié)論

從甘肅境內(nèi)3個(gè)種植區(qū)的雜交構(gòu)樹(shù)根際分離獲得10株固氮菌，并分析了其固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌的特性，為西北半干旱地區(qū)雜交構(gòu)樹(shù)根際微生物深入研發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。