油茶耐低磷指標(biāo)鑒定及芽苗砧篩選

曾 進(jìn)，趙 蘭，劉 娟，段永康，王淑媛，王振麗，蓋甜甜，任志華，郭曉敏，胡冬南

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 江西省森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330045；2. 江西省林業(yè)科技推廣和宣傳教育中心, 江西 南昌 330045)

磷是植物生長(zhǎng)所必需的元素之一，也是構(gòu)成植物體內(nèi)核酸、蛋白等大分子物質(zhì)的重要組分，對(duì)植物發(fā)育起著重要作用[1-2]。土壤中的磷主要以無(wú)機(jī)磷形式被植物吸收[3]，由于鐵、鋁等金屬離子易與土壤顆粒形成難溶性物質(zhì)，導(dǎo)致土壤中可以被植物吸收利用的有效磷含量極低，施入土壤的磷肥當(dāng)季利用率不足25%[4-5]。施磷肥是解決植物缺磷的直接方法，但過(guò)量磷肥會(huì)造成土壤板結(jié)，污染水體[6]，我國(guó)磷肥大多依賴進(jìn)口，價(jià)格高，且目前磷庫(kù)資源匱乏[7]，施磷肥并不是最佳解決途徑。研究發(fā)現(xiàn)，植物在遺傳過(guò)程中會(huì)形成不同的養(yǎng)分吸收策略[8]，同一植物不同品種間的營(yíng)養(yǎng)吸收、利用效率也有很大差異[9]。因此，從植物本身出發(fā)，研究其在不同磷營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)及養(yǎng)分差異，篩選不同磷營(yíng)養(yǎng)效率品種，是解決土壤有效磷缺乏，提高植物養(yǎng)分吸收利用效率的有效途徑。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是重要的木本油料樹種，生產(chǎn)上油茶良種通常采用嫁接繁殖[10]，砧木和穗條通過(guò)嫁接后成為一個(gè)共生體，砧木為植物提供養(yǎng)分和水分，砧木的營(yíng)養(yǎng)狀況直接影響了嫁接苗的成活率和生長(zhǎng)發(fā)育[11]。目前，砧穗互作研究主要集中在嫁接親和性上[12-14]，忽略了砧木本身營(yíng)養(yǎng)吸收利用差異帶來(lái)的影響。油茶主要分布在我國(guó)南方，而南方林地土壤普遍有效磷含量低[15]，限制了油茶的生長(zhǎng)。貧磷會(huì)減少油茶生物量、磷積累量[16-17]，還會(huì)影響油茶發(fā)芽和結(jié)實(shí)[18]。耐低磷油茶有較強(qiáng)的根系生長(zhǎng)能力，通過(guò)發(fā)達(dá)的根系分泌更多的酸性磷酸酶與有機(jī)酸來(lái)提高有效磷的利用[19-20]，還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)適應(yīng)低磷環(huán)境[21-22]。油茶低磷適應(yīng)性是從形態(tài)、生理多方面綜合表現(xiàn)的[16,18]，通過(guò)多指標(biāo)綜合篩選出耐低磷及磷高效油茶才是解決油茶林地土壤有效磷缺乏的關(guān)鍵。不同油茶無(wú)性系及砧穗組合對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)有顯著差異[17,23]。油茶為異花授粉植物，同一母本不同子代間為半同胞家系。其他植物研究表明，不同基因型半同胞家系的磷利用效率存在較大差異[24]，但油茶不同基因型半同胞家系的磷利用效率差異還未知。因此，本試驗(yàn)采用沙培法，研究江西省主推的12個(gè)品種油茶半同胞實(shí)生子代的耐低磷能力差異，篩選油茶耐低磷指標(biāo)，并得到耐低磷油茶砧木。油茶耐低磷指標(biāo)判別以及耐低磷芽苗砧篩選，對(duì)油茶良種選育與緩解磷肥消耗有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試油茶材料

試驗(yàn)材料是江西省主推的12個(gè)品種油茶半同胞實(shí)生子代，主推品種詳細(xì)信息見表1。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental material

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年收集12個(gè)品種油茶的成熟果實(shí)，脫殼取種籽，12月份播種沙藏，待長(zhǎng)出子葉后移至口徑為20 cm、河沙為基質(zhì)的圓底花盆中，每盆3株，每處理9盆，每盆底部放置托盤。所有油茶苗在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園大棚內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)基質(zhì)濕度適當(dāng)補(bǔ)充水分，每12 d左右澆灌1次營(yíng)養(yǎng)液。霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方為：Ca(NO3)2·4H2O 4 mmol·L-1,KNO33 mmol·L-1, MgSO4·7H2O 2 mmol·L-1, H3BO350 μmol·L-1, ZnSO4·7H2O 15 μmol·L-1, CuSO4·5H2O 2 μmol·L-1, MnSO4·H2O 50 μmol·L-1, H2MoO414 μmol·L-1, Fe-Na2-EDTA 100 μmol·L-1，磷 源 由KH2PO4提供，不足的鉀用KCl補(bǔ)充。2019年3月開始澆灌霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)8個(gè)月后測(cè)定各品種油茶幼苗在正常磷(1 mmol·L-1KH2PO4)和低磷(0 mmol·L-1KH2PO4)下的各項(xiàng)生長(zhǎng)及養(yǎng)分指標(biāo)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

每個(gè)處理選長(zhǎng)勢(shì)較一致的油茶收獲整株，洗凈根系，將根、莖、葉分離。用Expression 10000XL 3.49掃描儀掃描整個(gè)根系，Win RHIZO(Pro2012b)分析并計(jì)算總的根系指標(biāo)。CI-203手持式激光葉面積儀測(cè)定整株葉片形態(tài)。分離后的根、莖、葉放入烘箱中，100℃殺青30 min后65℃烘至恒質(zhì)量，用電子秤分別稱量根、莖、葉干質(zhì)量，并計(jì)算根冠比。H2SO4-H2O2消煮根、莖、葉后，Smart Chem 200全自動(dòng)智能化學(xué)分析儀測(cè)定各組織全磷，并計(jì)算磷積累量、磷利用效率。公式如下：

總磷積累量 (mg) = 總干質(zhì)量/全磷

總磷利用效率 (g·mg-1) = 總干質(zhì)量/總磷積累量

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 25.0進(jìn)行相關(guān)性、主成分、逐步回歸分析，結(jié)合隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)12個(gè)品種油茶半同胞實(shí)生子代的耐低磷順序，運(yùn)用 Heml 1.0 Heat map Illustrator 軟件進(jìn)行聚類熱圖分析。相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式[25]如下:

1.4.1 各指標(biāo)耐低磷系數(shù)

1.4.2 油茶綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值

式（2）中：μ(Xj)表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)值；Xmax表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值，Xmin表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值。

各綜合指標(biāo)權(quán)重：

式中：Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度及權(quán)重;Pj為各品種第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

1.4.3 油茶的耐低磷能力

式中：D表示在低磷脅迫條件下油茶耐低磷能力的綜合評(píng)價(jià)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各指標(biāo)耐低磷系數(shù)差異分析

由于不同品種油茶半同胞實(shí)生子代在低磷和正常磷下生長(zhǎng)差異較大，為消除種間誤差，用耐低磷系數(shù)能更準(zhǔn)確的反映其耐低磷能力大小[26]。表2表明：低磷下各油茶的地上干質(zhì)量、總根長(zhǎng)、總根表面積、葉面積、葉長(zhǎng)、葉寬以及總磷積累量與正常磷(P1)相比均有所下降(耐低磷系數(shù) ＜ 1)，其中，CL18的地上干質(zhì)量和葉面積耐低磷系數(shù)最接近1。除CL3和CL18外，其他油茶的根冠比耐低磷系數(shù)均大于1，除W1外的所有油茶總磷利用效率的耐低磷系數(shù)也都大于1，但是不同油茶的各指標(biāo)變化幅度不同。因此，用單項(xiàng)指標(biāo)的耐低磷系數(shù)來(lái)評(píng)判油茶的耐低磷能力大小，結(jié)果會(huì)有很大差異。

表2 油茶各指標(biāo)的耐低磷系數(shù)Table 2 Low-P tolerant coefficient of C.oleifera

2.2 各指標(biāo)相關(guān)性分析

由表3可以看出：許多性狀指標(biāo)間存在著較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，如地上干質(zhì)量與總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積、葉面積、總磷積累量呈顯著(P＜ 0.05)或極顯著(P＜ 0.01)正相關(guān)，總磷積累量與根干質(zhì)量、地上干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)(P＜ 0.01)，根全磷、地上全磷、植株全磷均與總磷利用效率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)。

表3 油茶各指標(biāo)耐低磷系數(shù)的相關(guān)性Table 3 Correlation of low-P tolerant of each character of C.oleifera

2.3 主成分分析

根據(jù)表4可知：主成分分析將14個(gè)與耐低磷相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)化為4個(gè)主成分，其特征根均大于1，其中，主成分1的貢獻(xiàn)率為26.546%，主成分2的貢獻(xiàn)率為22.948%，主成分3的貢獻(xiàn)率為21.353%，主成分4的貢獻(xiàn)率為19.550%。這4個(gè)主成分可作為評(píng)價(jià)油茶耐低磷的綜合指標(biāo)。

特征向量表明了各個(gè)性狀對(duì)主成分負(fù)荷影響的程度和方向。表4表明：第1主成分中，總根長(zhǎng)、總根表面積和總根體積有較大的正系數(shù)值，說(shuō)明這3個(gè)指標(biāo)對(duì)第1主成分有較大的正面影響，這3個(gè)指標(biāo)反映了根系生長(zhǎng)，因此，將第1主成分歸為根系形態(tài)指標(biāo)。第2主成分中，植株全磷、地上全磷有較大正系數(shù)值，植株總磷利用效率有較大負(fù)系數(shù)值，說(shuō)明第2主成分大時(shí)，植株全磷、地上全磷會(huì)增大，而植株總磷利用效率會(huì)降低；第2主成分主要反映了植株的磷營(yíng)養(yǎng)積累能力，第2主成分歸為磷營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。第3主成分中，根干質(zhì)量的系數(shù)值最大，第3主成分歸為根生物量指標(biāo)。第4主成分中，葉面積、葉寬、葉長(zhǎng)有較大的正向系數(shù)，第4主成分歸為葉形態(tài)指標(biāo)。

表4 各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 4 Coefficients of each comprehensive index and contributive ratio

2.4 綜合評(píng)價(jià)

2.4.1 隸屬函數(shù)分析 根據(jù)公式(2)計(jì)算12個(gè)品種油茶半同胞實(shí)生子代4個(gè)綜合指標(biāo)CI(j)的隸屬函數(shù)值μ(Xj)，由表5可知：83-4隸屬函數(shù)值最大(μ(X1)=1)，CL53隸屬函數(shù)值最小(μ(X1)=0)，表明83-4在CI(1)綜合指標(biāo)中耐低磷能力最強(qiáng)，而CL53耐低磷性最差。

2.4.2 權(quán)重計(jì)算 利用公式(3)計(jì)算其權(quán)重Wj，得到4個(gè)綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.294、0.254、0.236、0.216(表5)。

表5 油茶的綜合性狀指標(biāo)值、權(quán)重、μ(Xj)及綜合評(píng)價(jià)值（D）Table 5 The value of comprehensive index, weight, μ(Xj), and comprehensive valuation (D) in C.oleifera

2.4.3 綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)值(D）計(jì)算及品種聚類 利用公式(4)計(jì)算油茶耐低磷綜合評(píng)價(jià)值(D)，根據(jù)D值大小得到不同品種油茶的耐低磷能力順序?yàn)椋篊L18 ＞ CL40 ＞ G8 ＞ CL4 ＞ W2 ＞ 83-4 ＞ GX48 ＞W(wǎng)1 ＞ CL53 ＞ CL3 ＞ GF20 ＞ 84-3。

采用最大距離法對(duì)D值進(jìn)行聚類分析(圖1)，可以將12個(gè)品種油茶半同胞實(shí)生子代耐低磷能力分為3類，第Ⅰ類：GF20、CL3、84-3，為相對(duì)不耐低磷敏感類型；第Ⅱ類：W1、CL53、GX48,為中間型；第Ⅲ類：G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4，為相對(duì)耐低磷類型。

圖1 油茶耐低磷性聚類圖Fig.1 The cluster of low-P tolerance in C.oleifera

2.5 建立回歸模型和篩選鑒定指標(biāo)

為了解各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)與D值間的相關(guān)程度，篩選出關(guān)鍵的油茶耐低磷鑒定指標(biāo)，以綜合評(píng)價(jià)值D為因變量，各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)為自變量，做逐步回歸分析，建立回歸模型為：D= -0.960 + 0.666PA+0.341SPC+ 0.379TRA+ 0.460LW+ 0.197RPC,（方程決定系數(shù)R2= 0.997，P＜ 0.01）。根據(jù)方程結(jié)果，14個(gè)指標(biāo)篩選出PA（總磷積累量）、SPC（地上全磷）、TRA（總根表面積）、LW（葉寬）、RPC（根全磷）這5個(gè)相關(guān)性更強(qiáng)的指標(biāo)。對(duì)回歸方程的精度比較(表6)發(fā)現(xiàn)：精度均在95%以上，證明這5個(gè)指標(biāo)對(duì)油茶耐低磷性影響顯著，此方程可用來(lái)評(píng)價(jià)其他油茶耐低磷性。

表6 回歸方程的估計(jì)精度分析Table 6 Analysis of estimated accuracy of regression equation

3 討論

油茶新造林面積在逐年增加，大多數(shù)高產(chǎn)油茶已采取集約式經(jīng)營(yíng)，但是產(chǎn)量仍然不高，特別是單位面積的產(chǎn)量。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，同一林分，相同管理措施下，同一品種不同株之間的產(chǎn)量差別很大，果實(shí)產(chǎn)量從1 kg到20 kg不等。油茶優(yōu)良無(wú)性系主要通過(guò)芽苗砧嫁接的形式推廣和應(yīng)用，實(shí)際生產(chǎn)中通常以實(shí)生苗胚根作為砧木，在嫁接繁育時(shí)一般只注重選用良種穗條，對(duì)砧木的選擇往往是隨機(jī)的，大量研究表明，抗逆性強(qiáng)的砧木能提高嫁接植株的抗逆能力，且砧木相對(duì)穗條來(lái)說(shuō)對(duì)植株的影響程度更大[21,27]。磷缺乏是限制油茶高產(chǎn)的主要因素之一，在礦質(zhì)元素中，磷是對(duì)光合作用及碳水化合物在地上部分與根系之間分配起重要作用的元素[8]。本研究結(jié)果表明，不同品種油茶半同胞實(shí)生子代芽苗砧對(duì)磷的吸收和利用效率有很大差異，砧木耐低磷性差異可能是單株產(chǎn)量差異大的原因之一。楊邵研究表明，長(zhǎng)林18號(hào)種子和砧木形態(tài)表現(xiàn)優(yōu)，發(fā)芽率高，百粒質(zhì)量大，種間發(fā)芽率和百粒質(zhì)量變異小，但以長(zhǎng)林18號(hào)為砧木嫁接長(zhǎng)林23號(hào)、長(zhǎng)林40號(hào)、長(zhǎng)林18號(hào)穗條的油茶成活率低，親和性較差[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)林18號(hào)實(shí)生后代的耐低磷能力較強(qiáng)，但嫁接后成活率如何以及是否還能保持較強(qiáng)的耐低磷能力和優(yōu)良性狀，還值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)正常磷，低磷環(huán)境下大部分油茶實(shí)生子代的根冠比增大。植物缺磷時(shí)，受缺磷信號(hào)誘導(dǎo)，同化產(chǎn)物向根系轉(zhuǎn)運(yùn)量增加，由于缺磷使代謝紊亂，從而使可溶性碳水化合物合成及運(yùn)輸受阻，導(dǎo)致根系生物量增加同時(shí)減少地上生物量的積累，但是絕對(duì)生長(zhǎng)量是低于正常磷的[28-30]。根冠比增加被認(rèn)為是植物適應(yīng)低磷脅迫的反應(yīng)標(biāo)志[31]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，根冠比與根干質(zhì)量顯著正相關(guān)，與地上干質(zhì)量負(fù)相關(guān)但不顯著，根系干物質(zhì)的大量積累或許是造成根冠比增加的主要因素。12種油茶半同胞實(shí)生子代的地上干質(zhì)量、葉面積、葉長(zhǎng)、葉寬以及總磷積累量均受到低磷的抑制作用，可能是由于低磷脅迫抑制了植物的磷吸收，胞內(nèi)磷濃度降低，導(dǎo)致光合磷酸化水平下降，葉肉細(xì)胞減少，因此，葉片生長(zhǎng)受阻[32-33]。缺磷還會(huì)抑制油茶幼苗側(cè)根分化和生長(zhǎng)[34]，低磷下12種油茶芽苗砧的總根長(zhǎng)、總根表面積均減少了。

相關(guān)性結(jié)果表明，地上干質(zhì)量與總根長(zhǎng)、總根表面積、總根體積顯著或極顯著正相關(guān)，植物地上與地下生長(zhǎng)存在異速相關(guān)性，對(duì)養(yǎng)分的吸收也會(huì)互相影響[35]?？偭桌寐逝c植株全磷、地上全磷、根全磷極顯著負(fù)相關(guān)。有研究表明，隨著磷濃度的降低，油茶磷積累量會(huì)減少，而磷利用效率增加[17]。植物在調(diào)控耐低磷脅迫時(shí)有磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等很多基因參與其中，是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，與植物吸收和利用磷的相關(guān)指標(biāo)有很多，用單個(gè)指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)判耐低磷性[36]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，指標(biāo)間存在顯著關(guān)聯(lián)性，說(shuō)明指標(biāo)間存在重疊信息，需要綜合評(píng)價(jià)。用綜合評(píng)價(jià)值評(píng)判磷效率類型的方法已在多個(gè)植物上應(yīng)用[37-38]，因此，本研究以綜合指標(biāo)值聚類分析12個(gè)品種油茶半同胞子代實(shí)生苗的耐低磷性。

4 結(jié)論

低磷脅迫下12個(gè)品種油茶半同胞子代實(shí)生苗生長(zhǎng)受到抑制，根冠比和總磷利用效率增大是油茶適應(yīng)低磷的普遍反應(yīng)。GF20、CL3、84-3為相對(duì)不耐低磷類型；W1、CL53、GX48為相對(duì)中間型；G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4為相對(duì)耐低磷類型。以綜合評(píng)價(jià)值為自變量逐步回歸方程，鑒別出總磷積累量、地上全磷、總根表面積、葉寬、根全磷這5個(gè)指標(biāo)可用來(lái)判斷油茶的耐低磷性。