地稔總多酚的含量測定方法的研究*

錢 松，麻秀萍，楊秋麗，劉 靜，劉林莉

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

地稔為野牡丹科植物地稔MelastomadodecandrumLour.的新鮮或干燥全草，別名土茄子、山辣茄、鋪地錦、嘎狗嚕、地枇杷等，收載于2003版《貴州省中藥材﹑民族藥材質(zhì)量標準》中，主要分布在廣東、貴州、浙江、福建等地區(qū)。地稔歸心、肝、脾、肺經(jīng)，性涼，味甘、澀，主要功效為活血止血、清熱解毒，民間常用于治痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、子宮出血、崩漏、癰腫、痔瘡、盆腔炎、肝炎等病癥[1]。而現(xiàn)代藥理研究表明地稔止血與抗炎功效顯著，并有抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤等作用[2-4]。地稔的藥材資源豐富，使用范圍廣泛，臨床療效顯著，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

地稔所含化學(xué)成分多樣，其主要成分有黃酮類、多糖類、內(nèi)酯類、有機酸等成分[5-9]。而目前在地稔質(zhì)量控制等方面，多以沒食子酸、槲皮素等成分為主，鮮見地稔中多酚含量的報道[10]。因此，對民族藥地稔總多酚含量的測定方法的研究，為其質(zhì)量控制和深入開發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-5900型紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；FA2204N型分析天平(上海菁海儀器有限公司)；JP-150A型高速多功能粉碎機(永原市久品工貿(mào)有限公司)；水浴鍋(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)；AG285型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201605，含量為90.8%)：福林酚試劑(上海藍季生物，批號160825)；無水碳酸鈉(西隴科學(xué)股份有限公司，批號171016)；蒸餾水。

1.3 樣品

12批次地稔藥材分別購自貴州、福建、廣東等地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室孫慶文教授鑒定為野牡丹科植物地稔MelastomadodecandrumLour.的全草。12個批次地稔藥材產(chǎn)地來源見表1。

表1 樣品編號Tab.1 Numbers of the samples

2 方法及結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱定地稔藥材粉末(過2號篩)0.1 g，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入25 mL水，稱定重量，70 ℃水浴回流1 h，冷至室溫，再稱定重量，用水補重，過濾，取續(xù)濾液，即得，備用。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取沒食子酸對照品1.3 mg，置于25 mL棕色容量瓶內(nèi)，加水溶解，并定容至刻度線，搖勻，即得。

2.3 Folin-Ciocalteu法[11]

2.3.1 檢測波長選擇

① 待測樣品溶液光譜掃描

精密量取上述地稔供試品液1 mL，于25 mL容量瓶中，加10 mL水稀釋，搖勻，加入1.5 mL福林酚(FC)試劑，搖勻，在8 min內(nèi)加入10%的Na2CO3溶液6 mL，搖勻，用水稀釋至刻度，搖勻，避光1 h，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果如圖1。

圖1 待測樣品溶液光譜掃描圖Fig.1 Spectral scan of the solution of the sample to be tested

② 對照品溶液光譜掃描

精密量取沒食子酸對照品溶液0.2 mL，按2.3.1項下①方法進行光譜掃描，結(jié)果如圖2。

圖2 對照品溶液光譜掃描圖Fig.2 Spectral scan of the reference solution

③試劑空白溶液光譜掃描

精密量取地稔供試品液1 mL，于25 mL容量瓶，加水至刻度，搖勻，避光1 h，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，即得。結(jié)果如圖3。

圖3 試劑空白溶液光譜掃描圖Fig.3 Spectral scan of the solution of the samplewithout the reagents

④試樣空白溶液光譜掃描

精密量取1 mL水，按2.3.1項下①方法進行光譜掃描，結(jié)果如圖4。

圖4 試樣空白溶液光譜掃描圖Fig.4 Spectral scan of water

⑤ 待測樣品和待測標準品扣除溶劑空白的600～800 nm波長掃描，結(jié)果如圖5。

1-地稔藥材供試品；2-地稔浸膏供試品；3-沒食子酸標準品。圖5 待測樣品和標準品波長掃描圖Fig.5 Spectral scan of the sample to be tested andthe standard substance

由圖1至圖5，可得出在200～400 nm波長范圍空白溶劑吸收強，且吸收峰比較多，由此可知溶劑干擾影響較強，且在此范圍出現(xiàn)急尖的峰，造成誤差大，違反波長選取干擾最小原則，則不考慮200～400 nm為檢測波長；顯色劑空白在400～800 nm有吸收峰，試樣空白在400～600 nm只有一個吸收峰，在600～800 nm吸收峰相對較少，樣品溶液和標準品溶液在600～800 nm吸收增強，根據(jù)吸收最大原則，可將檢測波長范圍定在600～800 nm，如圖5，由扣除試樣空白表格和扣除顯色劑空白表格數(shù)據(jù)比較分析得到檢測波長為751 nm較適宜。故選擇751 nm波長為檢測波長。

2.3.2 福林酚(FC)試劑用量考察

精密量取6份地稔供試液1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入10 mL水稀釋搖勻，再分別加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL的FC試劑，搖勻，在8 min內(nèi)各加入10%Na2CO3溶液6 mL，搖勻，用水定容至刻度，30 ℃避光反應(yīng)1.0 h，以試劑空白作參比，在751 nm波長下測吸光值，結(jié)果如表2。

表2 福林酚(FC)試劑考察結(jié)果Tab.2 Results of tests on Folin phenol reagent

2.3.3 10%Na2CO3用量考察

精密量取6份供試品液1 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加入10 mL水稀釋搖勻，各加入福林酚(FC)試劑3 mL，搖勻，在8 min內(nèi)分別加入10%Na2CO3溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，搖勻，加水定容，30 ℃下避光1.0 h。再取1 mL地稔供試品液，相同操作方法，作為空白對照，在751 nm波長下測吸光值，結(jié)果如表3。

表3 10%碳酸鈉考察結(jié)果Tab.3 Results of tests on 10%Na2CO3

2.3.4 顯色時間考察

精密量取1 mL地稔樣品液，于25 mL容量瓶中，各加入10 mL水稀釋搖勻，加入3 mL福林酚，在8 min內(nèi)分別加入6 mL10% Na2CO3溶液搖勻，加水定容至刻度線，30 ℃下避光分別反應(yīng)0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，結(jié)果如表4。

表4 顯色時間考察結(jié)果Tab.4 Results of tests on color development time

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取沒食子酸對照品溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入10 mL水搖勻，加福林酚(FC)試劑3 mL，搖勻，在8 min內(nèi)分別加入10% Na2CO3溶液6 mL，搖勻，加水定容至刻度線，30 ℃下避光顯色2.0 h，751 nm波長下測吸光度，以沒食子酸濃度(c)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程Y=0.1404X+0.0089，r=0.9999。在1.0409～6.2456 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度考察

精密量取沒食子酸對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.4.1”中條件重復(fù)測定5次。結(jié)果沒食子酸對照品吸光度相對標準偏差RSD為0.15%，表明儀器精密度良好，如表5。

表5 顯色時間考察結(jié)果Tab.5 Results of tests on color development time

2.4.3 重復(fù)性考察

取地稔藥材粉末(貴州省羅甸縣邊陽鎮(zhèn))6份，精密稱取，按2.1項操作，得各樣品供試液。精密量取0.5 mL供試液，按“2.4.1”中條件方法進行檢測，計算多酚類含量，結(jié)果如表6。

表6 重復(fù)性考察結(jié)果Tab.6 Repeatability test results

2.4.4 穩(wěn)定性考察

地稔供試液顯色反應(yīng)完全(2.0 h)后測在0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時的吸光度，由吸光度的變化和RSD值來評價該比色法的穩(wěn)定性，結(jié)果如表7。

表7 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab.7 Stability test results

2.4.5 加樣回收率考察

取地稔藥材粉末(貴州省羅甸縣邊陽鎮(zhèn))6份，精密稱定，按樣品含量-對照品(1∶1)的比例加入對照品溶液(沒食子酸)，按2.1項操作，得各樣品供試液。精密量取0.5 mL供試液，按“2.4.1”中條件方法進行檢測，計算加樣回收率及RSD值，結(jié)果該方法準確性良好，如表8。

表8 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.8 Results of spiked recovery tests

2.5 不同產(chǎn)地樣品測定

按“2.1”項下方法制備各批次地稔藥材的供試液，平行兩次。按“2.4.1”中條件方法進行檢測，計算各批次多酚類含量，結(jié)果如表9。

表9 不同產(chǎn)地地稔總多酚含量的測定結(jié)果Tab.9 Determination results of total polyphenols inMelastoma dodecandrum from different producing areas

3 討論

通過Folin-Ciocalteu比色法對樣品溶液光譜掃描，得到其在波長751 nm處的吸收最大，干擾最小。并對FC試劑和10%Na2CO3用量體積和反應(yīng)時間等因素進行考察，優(yōu)選出地稔總多酚的最佳測定條件為FC試劑為3 mL，10%Na2CO3為6 mL，30 ℃下避光反應(yīng)2.0 h；沒食子酸含量在1.0409～6.2456 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9999；RSD均小于3.0%；所建立的福林酚比色法準確度高，精密度好，重現(xiàn)性好。用該方法對12批不同產(chǎn)地地稔總多酚含量進行測定，其含量范圍在1.97%～6.17%，其中以貴州榕江縣栽麻鄉(xiāng)含量最高。

現(xiàn)代藥理研究表明多酚具有抗衰老、抗氧化、保護心腦血管、抗炎、抗腫瘤等作用，而從地稔藥材總多酚含量的測定可得其含量較高，研究者可深入研究地稔總多酚在這些方面的藥理作用，建立譜效關(guān)系并探明作用機制與物質(zhì)基礎(chǔ)，加以開發(fā)利用。而目前在地稔已有文獻方面，鮮見地稔總多酚含量的報道。因此本實驗建立的地稔藥材中總多酚含量的測定方法，可為評價和控制民族藥地稔的質(zhì)量提供參考，也為其深入開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。