中藥材毛茛和揚(yáng)子毛茛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

熊 敏，龍 瀅，楊 鑫

(貴州省黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 黔東南州 556000)

本品為毛茛科植物毛茛RanunculusjaponicusThunb.或揚(yáng)子毛茛RanunculussieboldiiMiq.的新鮮或干燥全草。夏、秋二季采集，鮮用或洗凈沸水燙過，切段曬干。本品亦為我省少數(shù)民族用藥。最早記載于《本草拾遺》，毛茛為貴州省少數(shù)民族用藥，收載在《貴州草藥》(第一集)1970年7月第1版，書中描述毛茛為毛茛科毛茛RanunculusjaponicusThunb.的全草。民間苗醫(yī)用藥中習(xí)以新鮮全草或干燥全草入藥，口口相傳，廣為使用。毛茛科Ranunculaceae植物多為草本[1],由多種化學(xué)藥物組成,在我國有30屬約220種植物可供藥用，全草為外用發(fā)泡藥，治瘧疾、黃疸病；鮮根搗爛敷患處可治淋巴結(jié)核；也可作土農(nóng)藥。全草含毛茛苷，鮮根含原白頭翁素(protoanemonin,C5H4O2)0.12%，在干燥過程中，易發(fā)生分子重合反應(yīng)而變成無刺激性的結(jié)晶白頭翁素(anemonin,C10H8O4)[2]，為有毒植物。全草含原白頭翁素(protoanemonin,C5H4O2)及其二聚物白頭翁素(anemonin)，新鮮植物含白頭翁素0.05%。

毛莨(《本草拾遺》)[3][異名]水茛、毛建(《肘后方》)，毛建草、猴蒜(《本草拾遺》)，天灸(《夢溪筆談》),毛董、自灸(《綱目》)，鶴膝草、瞌睡草、老虎草、犬腳跡、老虎腳跡草、火筒青(《中國藥植志》),野芹菜(《福建民間草藥》)，辣子草、辣辣草(《民間常用草藥匯編》)，毛芹菜、老虎須(《江西民間草藥》),千里光、老鼠腳底板、爛肺草(《中藥植物圖鑒》)，三腳虎、水芹菜(《泉州本草》),撲地棕、翳子藥、一包針(《貴中草藥》)，魚疔草、鴨腳板、野芹菜、山辣椒、老虎腳爪草、毛芹菜、起泡草(《全國中草藥匯編》)?！度珖胁菟巺R編》[4]中對揚(yáng)子毛茛的別名有：辣子草、水辣菜。東北至華南以及長江中下游各省，全國大部分地區(qū)均有分布。我省各地均產(chǎn)。毛茛作為地方民間用藥研究甚少，尤其對于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，缺少相關(guān)科學(xué)文獻(xiàn)。

1 儀器和試藥

儀器：OLEICA ICC50 HD顯微鏡和LAS EZ顯像系統(tǒng)。

材料：常規(guī)顯微制片的刀片、載玻片、蓋玻片、鑷子、酒精燈。

試劑：水合氯醛、間苯三酚、濃鹽酸、稀甘油、蒸餾水、酒精(實驗所用的試劑均為分析純)。

藥材：所有實驗樣品均由本中心課題組采樣組的人采集，同批壓制標(biāo)本經(jīng)孫慶文教授鑒定，鑒定為毛茛科植物毛茛：RanunculusjaponicusThunb.或揚(yáng)子毛茛RanunculussieboldiiMiq.。鑒定結(jié)果及樣品來源見表1。

表1 供試樣品來源表Tab.1 Sources of the samples

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 毛茛原植物性狀鑒別

毛茛為多年生草本；莖高20～60 cm，有伸展的白色柔毛。基生葉和莖下部葉有長柄，長可達(dá)20 cm，葉片掌狀或五角形，長3.5～6 cm，寬5～8 cm，3深裂，中間裂片寬菱形或倒卵形，3淺裂，疏生鋸齒，側(cè)生裂片不等地2裂，莖中部葉有短柄，上部葉無柄，3深裂，裂片線狀被針形，上端有時淺裂成數(shù)齒?；S色，直徑約2 cm；萼片船狀橢圓形，外有柔毛；花瓣5，也有6～8，少數(shù)為6～8，少數(shù)為重瓣，圓狀寬倒卵形，基部蜜腺有鱗片。瘦果長2～3 mm，兩面突起，邊緣不顯著，有短喙稍向外曲。花期3月—5月，果期6月—8月。見圖1。

圖1 毛茛Fig.1 Ranunculus japonicus Thunb.

2.1.2 揚(yáng)子毛茛原植物性狀鑒別

揚(yáng)子毛茛為多年生草本。須根伸長簇生。莖鋪散，斜升，高20～50 cm，下部節(jié)偃地生根，多分枝，密生開展的白色或淡黃色柔毛。基生葉與莖生葉相似，為3出復(fù)葉；葉片圓腎形至寬卵形，長2～5 cm，寬3～6 cm，基部心形，中央小葉寬卵形或菱狀卵形，3淺裂至較深裂，邊緣有鋸齒，小葉柄長1～5 mm，生開展柔毛；側(cè)生小葉不等地2裂，背面或兩面疏生柔毛；葉柄長2～5 cm，密生開展的柔毛，基部擴(kuò)大成褐色膜質(zhì)的寬鞘抱莖上部葉較小，葉柄也較短?；ㄅc葉對生，直徑1.2～1.8 cm；花梗長3～8 cm，密生柔毛；萼片狹卵形，長4～6 mm，為寬的2倍，外面生柔毛，花期向下反折，遲落；花瓣5，黃色或上面變白色，狹倒卵形至橢圓形，長6～10 mm，寬3～5 mm，有5～9條或深色脈紋，下部漸窄成長爪，蜜槽小鱗片位于爪的基部；雄蕊20余枚，花藥長約2 mm；花托粗短，密生白柔毛。聚合果圓球形，直徑約1 cm；瘦果扁平，長3～4(5) mm，寬3～3.5 mm，為厚的5倍以上，無毛，邊緣有寬約0.4 mm的寬棱，喙長約1 mm，成錐狀外彎。花果期5月至10月,見圖2。

圖2 揚(yáng)子毛茛Fig.2 Ranunculus sieboldii Miq.

2.1.3 毛茛性狀

須根多數(shù)，簇生。莖中空，長達(dá)30～60 cm。莖、葉、柄都有伸展的柔毛?；~和莖下部葉有長柄，葉柄長達(dá)15 cm；完整葉片展平后呈掌狀或五角形，長6 cm，寬7 cm，基部心形，3深裂，中央裂片寬，菱形或倒卵形，3淺裂疏生鋸齒，側(cè)裂片不等2裂；莖上部葉較小，3深裂，裂片披針形，有尖齒牙；最上部葉寬線形，全緣，無柄?；ㄖ睆? cm；萼片5，淡綠色，船狀橢圓形，外有柔毛；花瓣5，倒卵形，黃色，長0.6～1.1 cm，基部有短爪，蜜槽鱗片長0.1～0.2 cm；雄蕊和心皮部均為多數(shù)。聚合果近球形，直徑0.4～0.5 cm。氣微，味辛、微苦。見圖3。

圖3 晾干后毛茛Fig.3 Dried Ranunculus japonicus Thunb.

說明：原標(biāo)準(zhǔn)描述毛茛的葉為五角形，而根據(jù)《中藥大辭典》[5]、《中國高等植物圖鑒》以及實物標(biāo)本等綜合描述，建議葉型修訂為呈掌狀或五角形較為準(zhǔn)確。

2.1.4 揚(yáng)子毛茛性狀

莖長達(dá)30 cm，多少密生伸展的白色或淡黃色柔毛?；~為三出復(fù)葉，葉柄長達(dá)2～5 cm；葉片寬卵形，長2～4.5 cm，寬3.2～6 cm，下面疏被柔毛，中央小葉具長或短柄，寬卵形或菱狀卵形，3淺裂至深裂，裂片上部邊緣疏生鋸齒，側(cè)生小葉具短柄，較小，不等2裂。花直徑1.2～1.8 cm，具長梗，萼片5，狹卵形，外有柔毛；花瓣5，近橢圓形，黃色，長達(dá)0.7 cm，基部有長爪，蜜槽小鱗片位于爪基部。見圖4。

圖4 晾干后揚(yáng)子毛茛Fig.4 Dried Ranunculus sieboldii Miq.

2.2 顯微鑒別

2.2.1 毛茛葉撕片

葉上表皮細(xì)胞為類圓行、長圓形或不規(guī)則圓形，非腺毛單細(xì)胞，濃密，多見，無氣孔；葉下表皮細(xì)胞呈不規(guī)則深波狀，比葉上表皮細(xì)胞大約一倍，氣孔多見，不定式，包圍細(xì)胞線型，非腺毛單細(xì)胞，濃密。毛茛葉葉撕片顯微特征照片見圖5。

圖5 毛茛葉片顯微特征Fig.5 Microscopic characteristics of Ranunculusjaponicus Thunb.leaves

2.2.2 揚(yáng)子毛茛葉撕片

本品葉表面觀：葉上表皮細(xì)胞為類圓行、長圓形或不規(guī)則圓形，非腺毛單細(xì)胞，濃密，多見，無氣孔；葉下表皮細(xì)胞呈不規(guī)則深波狀，比葉上表皮細(xì)胞大約一倍，氣孔多見，不定式，包圍細(xì)胞線型，非腺毛單細(xì)胞，濃密。揚(yáng)子毛茛葉撕片顯微特征照片見圖6。

圖6 揚(yáng)子毛茛葉片顯微特征Fig.6 Microscopic characteristics of Ranunculussieboldii Miq.leaves

2.2.3 毛茛橫切面特征

表皮為一列方形或類方形的厚壁細(xì)胞，表皮細(xì)胞有的著生有單細(xì)胞非腺毛，皮層為3～4列薄壁細(xì)胞，類圓形或不規(guī)則形，內(nèi)含淀粉粒,中柱形成層不明顯，外韌型維管束排列成環(huán)，莖下段的外韌型維管束約27個，中段的外韌型維管束約22個，上段花柄或果柄的外韌型維管束約10個，中柱部位的各細(xì)胞均木化，中空，無髓。毛茛莖橫切面顯微照片顯示各組織的排列關(guān)系，見圖7。

圖7 毛茛莖橫切面顯微照片F(xiàn)ig.7 Micrograph of cross section of Ranunculusjaponicus Thunb.stem

2.2.4 揚(yáng)子毛茛橫切面特征

莖中下段的橫切面外韌型維管束約11～14個，上段花柄或果柄的外韌型維管束8～10個。見圖8。

圖8 揚(yáng)子毛茛莖橫切面顯微照片F(xiàn)ig.8 Micrograph of cross section of Ranunculus sieboldii Miq.stem

2.2.5 毛茛粉末特征

粉末為棕色或灰綠色?；ǚ哿６嘁姡瑘A形、類圓形或類方形，有點狀雕紋和四個萌發(fā)孔；花冠碎片呈金黃色或黃白色，表皮細(xì)胞分化為乳突狀或星狀，非腺毛眾多，單細(xì)胞，多斷裂為長短不一的段，完整者400 μm、700 μm、1200 μm，直徑10～20 μm，導(dǎo)管為梯紋、具緣紋孔或網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑40～120 μm，纖維多破碎或斷裂，直徑20～40 μm，薄壁細(xì)胞含淀粉粒，淀粉粒臍點和層紋不明顯。毛茛粉末圖(非腺毛、導(dǎo)管、纖維、花粉粒、花冠碎片薄壁細(xì)胞)見圖9。

圖9 毛茛粉末顯微特征Fig.9 Microscopic characteristics of Ranunculusjaponicus Thunb.powder

2.2.6 揚(yáng)子毛茛粉末特征

非腺毛眾多，單細(xì)胞，多斷裂為長短不一的段，完整者長600 μm、1000 μm、1800 μm，直徑10～20 μm，導(dǎo)管為網(wǎng)紋、具緣紋孔或梯紋導(dǎo)管?；ǚ哿＞唿c狀雕紋，萌發(fā)孔不明顯；薄壁細(xì)胞含多數(shù)淀粉粒。見圖10。

圖10 揚(yáng)子毛茛粉末顯微特征Fig.10 Microscopic characteristics of Ranunculussieboldii Miq.powder

2.3 薄層鑒別

原標(biāo)準(zhǔn)無薄層鑒別項，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研毛茛和揚(yáng)子毛茛所含成分主要是原白頭翁素，而原白頭翁素?zé)岱€(wěn)定性較差，易轉(zhuǎn)變?yōu)榘最^翁素，而原白頭翁素和白頭翁素市場無對照品可售，故采用自身對照藥材為對照，對其進(jìn)行薄層鑒別。按照2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進(jìn)行試驗，分別稱取毛茛和揚(yáng)子毛茛各1 g，樣品來源：1毛茛(余慶縣城關(guān)20180426)、2毛茛(施秉縣城關(guān)20180427)、3毛茛(凱里三棵樹20180516)、4毛茛(對照藥材)、5揚(yáng)子毛茛(貴陽市青巖鎮(zhèn)20170505)、6、揚(yáng)子毛茛(荔波縣佳榮鎮(zhèn))、7揚(yáng)子毛茛(開發(fā)區(qū)甕義20170518)、8揚(yáng)子毛茛(對照藥材)，在溫度16 ℃,濕度80%條件下，用95%乙醇提取，超聲30 min后，過濾，濾液蒸干,殘渣分別加95%乙醇各1 mL使溶解，吸取上述供試品溶液各5 μL，點于任意一個生產(chǎn)廠家薄層板上，使用展開劑：(環(huán)己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展開，取出晾干，置于紫外光(365 nm)下檢視薄層色譜圖斑點清晰。結(jié)論：在此試驗條件下，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰，故選擇將此項列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。見圖11。

圖11 薄層色譜圖Fig.11 Thin-layer chromatogram

2.4 檢查

2.4.1 水分

原標(biāo)準(zhǔn)無此項目，6批樣品參照《中國藥典2015年版》(四部)(通則0832第二法)測定結(jié)果為11.8%～12.4%，平均值12.2%(見表2)，根據(jù)《中國藥典2015年版》(四部)通則規(guī)定中藥飲片水分通常不得超過13.0%，故水分暫定為不得超過13.0%，建議收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

表2 水分含量Tab.2 Moisture content

2.4.2 總灰分

原標(biāo)準(zhǔn)無此項目，樣品測定結(jié)果為8.3%～12.9%(表3)，平均值11.1%，暫定總灰分13.0%，建議收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

表3 總灰分含量Tab.3 Total ash content

2.4.3 浸出物

原標(biāo)準(zhǔn)無此項目，照醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定，分別用乙醇、稀乙醇、水作溶劑，以熱浸法和冷浸法測定1批毛茛(MG03)浸出物含量，測定結(jié)果見表4。根據(jù)測定結(jié)果，稀乙醇和水熱浸的結(jié)果比較接近，而且稀乙醇比較容易過濾，故用稀乙醇作溶劑，按《中國藥典》(2015版通則2201)熱浸法，測定了6批樣品，測定結(jié)果為21.1%～32.7%(見表5)。根據(jù)測定結(jié)果，暫定浸出物標(biāo)準(zhǔn)不得少于20.0%，建議收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

表4 浸出物含量Tab.4 Extract content

表5 稀乙醇熱浸出物含量Tab.5 Contents of dilute ethanol thermal extract

3 討論

參照薄層色譜法試驗(《中國藥典》2015年版四部通則0502)方法學(xué)考察，對毛茛和揚(yáng)子毛茛的薄層色譜鑒別考察了不同的提取溶劑、不同溫濕度、不同廠家薄層板，不同產(chǎn)地和穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明，正文的方法為最佳方法,該方法色譜清晰，專屬性強(qiáng)。該文章還研究毛茛和揚(yáng)子毛茛原植物和晾干后性狀鑒別；毛茛和揚(yáng)子毛茛葉撕片的顯微鑒別；毛茛和揚(yáng)子毛茛橫切面特征；毛茛和揚(yáng)子毛茛粉末特征。原標(biāo)準(zhǔn)描述毛茛的葉為五角形，而根據(jù)《中藥大辭典》《中國高等植物圖鑒》以及實物標(biāo)本等綜合描述，建議葉型修訂為呈掌狀或五角形較為準(zhǔn)確。

本實驗參照《中國藥典2015年版》(四部)(通則0832第二法、通則2302、通則2201)分別對毛茛和揚(yáng)子毛茛的水分、總灰分、浸出物進(jìn)行檢查，水分測定平均值為12.2%，初步擬定為不得超過13.0%；總灰分測定平均值為11.1%，初步擬定為不得超過13.0%；浸出物測定平均值為26.8%，初步擬定為不得低于20.0%。該研究制定的方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效控制毛茛和揚(yáng)子毛茛質(zhì)量，該方法將為黔產(chǎn)毛茛和揚(yáng)子毛茛載入地方標(biāo)準(zhǔn)提供試驗基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。