松油烯-4-醇抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞增殖、遷移與侵襲并促進其凋亡

詹 琪，曾智銳，任長城，凌園果，曾 茜，劉孟濤，徐卡婭，出良釗，劉 健,5

(貴州醫(yī)科大學 1.臨床醫(yī)學院、2.基礎醫(yī)學院生理學教研室，3.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，4.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，5.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤[1]，由多種因素相互作用導致，具有高度侵襲性、代謝異常和血管生成等惡性生物學特征[2]，惡性膠質(zhì)瘤病死率極高，其中位生存時間僅約15個月，有著較高的復發(fā)率，手術(shù)切除是主要的治療手段，術(shù)后的輔助分級放療結(jié)合化療也占據(jù)很重要的地位。目前一線化療藥替莫唑胺療效明顯，但受限于耐藥性[3-4]，因此，研發(fā)新藥物對治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有重大的臨床意義。

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶非受體型1和2(PTPN1、PTPN2)屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，一直被認為對胰島素和瘦素受體信號傳導有負調(diào)控作用[5]。近期報道，它在癌細胞中異常表達，并作為一種重要的癌基因發(fā)揮作用，PTPN1促進增殖、集落形成和遷移，而降低癌細胞系的凋亡[6]。PTPN2在膠質(zhì)瘤中表達顯著增高，在T98G細胞中沉默PTPN2基因明顯抑制細胞集落形成和誘導細胞凋亡,能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長[7],故PTPN1/2有望成為抗膠質(zhì)瘤藥物作用的蛋白靶點。

從植物材料中提取的精油及其成分已被發(fā)現(xiàn)具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol，化學式：C10H18O,T4O)是精油的主要有效成分之一。近期報道表明，T4O通過選擇性誘導抗腫瘤作用，在黑色素瘤細胞系中引起細胞死亡和細胞周期阻滯[8]。但T4O在膠質(zhì)瘤中存在何種作用與機制暫未知。本研究擬探討T4O對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87與U251細胞惡性生物學行為的影響與潛在作用靶點，優(yōu)化膠質(zhì)瘤治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87與U251購自中國科學院上海細胞庫

1.1.2試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液(貨號：A4192101)、胎牛血清(貨號：10099141C)和2.5 g·L-1胰蛋白酶(貨號：25200-056)購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO，貨號：D2650)、細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CCK-8，貨號：CA1210)、結(jié)晶紫染色液(貨號：G1063)、蛋白裂解液RIPA(貨號：R0020-100)、蛋白酶抑制劑PMSF(貨號：P0100)和BCA蛋白定量試劑盒(貨號：PC-0020-500)購自北京索萊寶生物工程有限公司；Transwell小室(貨號：3422)購自北京明陽科華生物科技有限公司；SDS-PAGE制膠試劑盒(貨號：P0690)與Annexin-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號：PR30019)以及兔源性多克隆抗體PTPN1(貨號：11334-1-AP)、PTPN2(貨號：11214-1-AP)、Bcl-2(貨號：12789-1-AP)、Bax(貨號：50599-2-Ig)、caspase-3(貨號：19677-4-AP)、MMP-2(貨號：10373-2-AP)、MMP-9(貨號：10375-2-AP)與鼠源性β-actin單克隆抗體(貨號：66009-1-Ag)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；極超敏ECL化學即用型底物曝光液(貨號：AR1190)購自武漢博士德生物公司；松油烯-4-醇(純度>98%)(貨號：329-52972)購自天津一方科技有限公司。

1.1.3儀器 超凈工作臺(型號：SW-CJ-2FB)購自上海滬靜醫(yī)療器械有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號：DHP-9032(A))購自上海飛越實驗儀器公司；多功能酶標儀(SpectraMax M3)購自美國Molecular Devices公司；倒置顯微鏡(型號：XDS-3)購自上海精密儀器儀表有限公司；搖擺搖床(型號：SHRK07AL1)購自深圳現(xiàn)代豪方儀器儀表科技有限公司；Novocyte型流式細胞儀(型號：D2060R)購自杭州艾森生物有限公司；Western blot凝膠成像系統(tǒng)(型號：FluorChemM)購自北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87和U251添加含10% FBS 的DMEM高糖培養(yǎng)基，放置于37 ℃、含5% CO2的精密恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)隔日更換新鮮培養(yǎng)基。匯合度達0.8以上，則進行消化傳代以及凍存操作。

1.2.2用CCK-8法檢測T4O對細胞增殖的影響 將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U87和U251(均2×103個/孔)種于96孔板上。分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞，每組設置6個復孔。24 h后，取CCK-8液與含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基以1 ∶9的比例混勻；96孔板棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的混合液，放置恒溫培養(yǎng)箱，時長為2 h。將多功能酶標儀中波長調(diào)至450 nm并讀取吸光度(OD值)。各組相對增殖率/%=(觀察組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3克隆平板法檢測T4O對細胞克隆形成能力的影響 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87和U251(均1×103個/皿)接種于細胞培養(yǎng)皿(直徑=6 cm)上。細胞貼壁后，分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。15 d后，棄培養(yǎng)液，4 %多聚甲醛溶液固定20 min，隨后0.5%結(jié)晶紫常溫染色20 min。置于烘箱烤干后拍照記錄。計算各組細胞克隆形成數(shù)。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測T4O對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響 用胰蛋白酶消化U87與U251細胞后，按照1×104個/孔的密度接種于6孔板中。以濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理24 h后，棄培養(yǎng)液，用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL不含EDTA的胰酶消化后，4 ℃離心5 min收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，4 ℃離心5 min，收集1 × 105細胞，吸棄PBS，加1×Binding Buffer 100 μL重懸細胞，添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混勻后避光反應20 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后置于冰上，于流式細胞儀檢測。其中，Q1象限區(qū)域是機械損傷所導致死亡細胞百分比，Q2象限區(qū)域是晚期凋亡細胞百分比,Q3象限區(qū)域是早期凋亡細胞百分比，Q4象限區(qū)域是存活細胞百分比。

1.2.5劃痕愈合實驗檢測T4O對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移能力的影響 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U87和U251(均2 × 105個/孔)接種于6孔板上。待細胞匯合度達90%時，以無血清培養(yǎng)液饑餓細胞24 h。以200 μL移液器槍頭在細胞單層上劃一直線。PBS 洗3次以清除漂浮的細胞，倒置顯微鏡下記錄 0 h劃痕的情況。分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞24 h后再次記錄劃痕情況。ImageJ軟件測量劃痕0 h和24 h的面積，24 h內(nèi)劃痕的愈合面積為同一處理組0 與24 h劃痕的面積之差。相對遷移率/%=各藥物處理組24 h內(nèi)愈合面積/對照組24 h內(nèi)愈合面積×100%。

1.2.6Transwell小室法檢測T4O對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的影響 共300 μL的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87和U251的細胞懸液(含2×105個細胞)加入到預先鋪好Matrigel的Transwell上室里，然后分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。Transwell下室中加入700 μL的完全培養(yǎng)液(含10%FBS)作為誘導物。在恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，用4 %多聚甲醛溶液常溫固定細胞20 min和0.5%濃度的結(jié)晶紫常溫染色20 min。PBS洗掉殘留結(jié)晶紫后，在烤箱烘干殘留水分。每孔隨選4個視野(× 100)，于顯微鏡下拍照記錄并計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.2.7生物信息學預測與分析T4O作用靶點 根據(jù)T4O的藥效團，利用Swissprediction軟件，預測T4O作用的蛋白靶點，獲取靶點后應用 Cytoscape 軟件可視化T4O調(diào)控的靶點。隨后利用公共數(shù)據(jù)庫GEPIA分析靶點的表達量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總生存率的關(guān)系。P<0.05則認為靶點的表達量與患者的總體生存率相關(guān)。與患者總體生存率相關(guān)的靶點則認為是T4O在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中重要的作用靶點。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法檢測PTPN1、PTPN2以及其下游與增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達 神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理24 h后，用含 1% PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，收集蛋白液后以BCA法定量。蛋白(20 μg)加入到10%的 SDS-PAGE膠中，120 V恒壓電泳1.5 h，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后，分別加入稀釋度為1 ∶1 000的兔源性PTPN1多克隆抗體、兔源性PTPN2多克隆抗體、兔源性Bcl-2多克隆抗體、兔源性Bax多克隆抗體、兔源性pro-caspase-3多克隆抗體、兔源性cleaved caspase-3多克隆抗體、兔源性MMP-2多克隆抗體、兔源性MMP-9多克隆抗體以及鼠源性β-actin單克隆抗體，在4 ℃條件下放置搖床過夜。用TBST洗滌3次，15 min/次，以1 ∶1 500的體積稀釋比稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠 IgG后加入，進行室溫孵育2 h，后用TBST洗滌3次，15 min/次。曝光后檢測各蛋白條帶的灰度值，重復3次。

2 結(jié)果

2.1 T4O抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的增殖CCK-8檢測結(jié)果(Fig 1)顯示，0(即DMSO對照)、1、2 和4 μmol·L-1的T4O處理 24 h后，U87細胞的相對增殖率分別為(99.25±2.60)%、(87.47±2.63)%、(76.24±1.78)% 和(64.72±3.03)%；U251細胞的相對增殖率分別為(100.03±1.88)%、(85.70±3.79)%、(73.52±6.60)% 和(57.41±5.71)%。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的增殖率均出現(xiàn)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的增殖。

Fig 1 Effects of different concentrations of T4O on 24 h proliferation of glioma U87 and U251 cells detected by CCK-8

2.2 T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的克隆形成能力克隆平板實驗結(jié)果(Fig 2)顯示，0(即DMSO對照)、1、2 和 4 μmol·L-1的T4O處理組中，U87細胞克隆形成數(shù)依次為(886±14)個、(782±10)個、(417±11)個和(102±3)個；U251細胞克隆形成數(shù)依次為(894±14)個、(743±15)個、(121±20)個和(46±8)個。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的克隆形成數(shù)均出現(xiàn)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的克隆形成能力。

2.3 T4O明顯促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的凋亡流式細胞凋亡實驗結(jié)果(Fig 3)顯示，0(即DMSO對照)和 1、2、4 μmol·L-1的T4O處理24 h后, U87細胞凋亡率分別為(1.34±0.03)%、(4.10±0.06)%、(7.93±0.10)% 和(11.56±0.53)%；U251細胞凋亡率分別為(2.09±0.07)%、(3.55±0.12)%、(6.38±0.13)%和(6.71±0.07)%。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的凋亡率均出現(xiàn)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的凋亡。

2.4 T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的遷移劃痕愈合實驗結(jié)果(Fig 4)顯示，0(即DMSO對照)和 1、2、4 μmol·L-1的T4O處理 24 h 后，U87細胞的相對遷移率分別為(99.99±1.33)%、(71.47±1.87)%、(42.07±1.55)%和(32.51±1.57)%；U251細胞的相對遷移率分別為(100.10±1.56)%、(73.84±5.18)%、(50.48±4.38)%和(25.19±2.23)%。與對應細胞系的對照組相比，各濃度松T4O處理組細胞的相對遷移率均出現(xiàn)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的遷移能力。

Fig 2 Effects of T4O on colony formation of glioma U87 and U251 cells detected by colony formation assay n=3)

Fig 3 Effects of T4O on U87 and U251 cell apoptosis detected by flow cytometry n=3)

2.5 T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的侵襲Transwell小室實驗結(jié)果(Fig 5)顯示，0(即DMSO對照)和1、2、4 μmol·L-1的T4O處理24 h, U87細胞每視野下侵襲過膜的細胞數(shù)為(389±11)個、(282±9)個、(184±7)個 和(45±5)個；U251細胞侵襲過膜的細胞數(shù)為(325±8)個、(174±10)個、(107±4)個和(17±4)個。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的每視野下侵襲過膜細胞數(shù)均出現(xiàn)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。提示T4O明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的侵襲能力。

Fig 4 Effects of T4O on glioma U87 and U251 cell migration determined by Scratch healing test (×40) n=3)

Fig 5 Effects of T4O on invasion of glioma U87 and 251 cells determined by Transwell experiments (×100) n=3)

2.6 T4O的作用靶點預測與分析根據(jù)T4O的藥效團，我們利用Swissprediction軟件，預測其作用靶點。發(fā)現(xiàn)T4O有37個作用靶點(Fig 6A)。進一步，我們利用公共數(shù)據(jù)庫GEPIA分析靶點與神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)：靶點PTPN1和PTPN2高表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總體生存率較低(Fig 6B)。提示PTPN1和PTPN2可能是T4O在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的重要作用靶點。

2.7 T4O對PTPN1、PTPN2、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、MMP-2與MMP-9表達的影響用不同濃度(0、1、2、4 μmol· L-1)的T4O處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞后，免疫印跡法檢測結(jié)果(Fig 7)顯示，與各細胞系的對照組(即0 μmol·L-1的T4O組)相比，各濃度處理組PTPN1、PTPN2、MMP-2、MMP-9與Bcl-2的相對表達量均見明顯減少，cleaved caspase-3與Bax蛋白的相對表達量均見明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示T4O顯著抑制其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的關(guān)鍵靶點蛋白PTPN1和PTPN2的表達以及下游相關(guān)增殖遷移和侵襲相關(guān)指標。

Fig 6 Prediction of protein target of T4O action(A)and relationship between target protein and glioma progression(B)

Fig 7 Effects of T4O on expression of PTPN1, PTPN2, Bcl-2, Bax, pro-caspase-3, cleaved caspase-3, MMP-2 and MMP-9 protein in U87 and U251 cells detected by Western blot n=3)

3 討論

腦部最常見腫瘤類型為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性膠質(zhì)瘤危害極高，最主要生物特性為侵襲性，患者5年生存率處于較低水平，表明膠質(zhì)瘤的臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。臨床上用于治療膠質(zhì)瘤的藥物有很多，如替莫唑胺,其在低級別膠質(zhì)瘤中展示出了較好的療效，但面對級別較高的膠質(zhì)母細胞瘤，易產(chǎn)生耐藥與復發(fā)，因此尋找新的、安全的并且有效的抗不同級別膠質(zhì)瘤藥物是基礎和臨床研究的一項關(guān)鍵任務[9]。

T4O是從中藥姜黃中提煉出的一種豐度較高的松油烯類有效成分[10]。T4O目前在臨床上主要作為治療皮膚真菌病及寄生蟲感染藥物，可內(nèi)服或外敷，安全性高，毒副作用少[11]。臨床上，多種松油烯類物質(zhì)已成功地用作抗癌化療藥物，如長春新堿和紫杉醇等。潛在表明，骨架結(jié)構(gòu)為松油烯類的化合物如T4O等可能也具有抗腫瘤作用。近些年研究也證實這一推測。如T4O能夠抑制人黑色素瘤細胞的生長，并對其耐藥變異體更有效，它們在質(zhì)膜中表達高水平的P-糖蛋白，克服了P-糖蛋白陽性腫瘤細胞對caspase依賴性凋亡的抗性[12]。再如T4O誘導細胞色素C從線粒體釋放和Bid蛋白在caspase-8刺激后被切割，從而誘導人白血病HL-60細胞自噬與凋亡[13]。本研究以神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87(起源于高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤)和U251細胞(起源于低級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤)為細胞模型，發(fā)現(xiàn)T4O均明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細胞的增殖、侵襲與遷移，并誘導了其凋亡，表明T4O在低級別膠質(zhì)瘤與高級別膠質(zhì)瘤中均具有明顯療效。提示T4O是一種良好的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物。

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類(PTPs)是負責催化酪氨酸去磷酸化這一過程，PTPN1與PTPN2是PTPs的眾多類型中很常見的兩種類型，他們的催化結(jié)構(gòu)域具有>74%的一致性[14]。近期大量研究表明PTPN1、PTPN2在膠質(zhì)瘤中的表達異常增高且與患者不良預后相關(guān)[15]。Tao等[16]發(fā)現(xiàn)PTPN1在膠質(zhì)瘤組織中過度表達，并且通過MAPK/ERK和PI3K/AKT通路促進膠質(zhì)瘤的進展；Wang等[17]研究表明，PTPN2在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達水平升高，與IDH野生型和間充質(zhì)亞型膠質(zhì)瘤有關(guān)，并與膠質(zhì)瘤的免疫應答和炎癥反應密切相關(guān)。本研究中，基于藥效團模型，運用生物信息學手段發(fā)現(xiàn)PTPN1與PTPN2為T4O的作用靶點，且PTPN1和PTPN2高表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者總體生存率較低。提示：PTPN1和PTPN2是T4O在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的重要作用蛋白，其發(fā)揮生物學功能可能是通過抑制PTPN1和PTPN2介導的。進一步通過Western blot發(fā)現(xiàn)，T4O能夠明顯抑制PTPN1與PTPN2的表達，并且其下游侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9與抗凋亡因子 Bcl-2的表達量均見減少，同時增加了促凋亡因子Bax的表達量。

綜上所述，T4O可能通過靶向PTPN1與PTPN2來抑制膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲與遷移，并促進其凋亡。T4O展現(xiàn)了其抗膠質(zhì)瘤的潛在價值，有望成為治療高低級別膠質(zhì)瘤的有效藥物。