IL-22/IL-22BP軸在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用

周 恒，黃三雄，賀 穎，何曉瑋，郭 璐，魯 晟

(湖州市第一人民醫(yī)院，湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.藥劑科、2.肝膽胰外科、3.中心實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000)

肝臟缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是肝移植、失血性休克及肝切除等肝臟手術(shù)中不可避免的過(guò)程[1]。作為一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，缺血/再灌注損傷是造成術(shù)后肝功能不全及肝移植術(shù)后早期肝功能衰竭的重要原因之一[2]。然而，當(dāng)前對(duì)肝臟IRI的研究仍不夠完全，具體作用機(jī)制尚不完全清楚[3]，且目前尚無(wú)公認(rèn)有效的干預(yù)治療方法[2,4]，因此，進(jìn)一步深入對(duì)肝臟IRI及其潛在機(jī)制的研究對(duì)肝臟外科的發(fā)展尤為必要。

白細(xì)胞介素22(interleukin 22, IL-22)自2000年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其在多種類(lèi)型肝損傷，包括缺血/再灌注損傷中的保肝作用被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[5]。IL-22結(jié)合蛋白(IL-22 binding protein, IL-22BP)是一種可溶性IL-22受體，與IL-22的親和力比膜受體(IL-22R1)高20-1 000倍，可通過(guò)阻止IL-22與膜受體的結(jié)合而起到抑制IL-22的作用[6-8]。近年有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)IL-22/IL-22BP軸的失衡與多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切，但其在具體疾病中的具體作用尚不能完全闡明[9-11]。

本研究通過(guò)在小鼠建立不同時(shí)間肝臟缺血(30、90和150 min)/再灌注模型，以模擬患者肝臟遭受不同程度缺血/再灌注損傷。通過(guò)檢測(cè)肝損傷程度、體內(nèi)IL-22/IL-22BP表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)通路激活情況，探討IL-22/IL-22BP軸在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用及可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8-10周齡C57BL/6雄性小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，SPF級(jí)。

1.2 藥物與試劑重組小鼠IL-22(上海近岸科技有限公司，批號(hào)：C047)，小鼠IL-22 ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司，批號(hào)：CME0033)，STAT3(批號(hào)：9139S)、p-STAT3(Tyr 705，批號(hào): 9145S)和cyclinD1(批號(hào)：2922S)一抗抗體購(gòu)自于CST公司(美國(guó))。

1.3 主要儀器血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性水平由自動(dòng)化學(xué)分析儀(Hitachi3100，日本)測(cè)定。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模小鼠隨機(jī)分為4組：短時(shí)間肝臟缺血/再灌注組(ST-IRI)，中等時(shí)間肝臟缺血/再灌注組(MT-IRI)，長(zhǎng)時(shí)間肝臟缺血/再灌注組(LT-IRI)以及長(zhǎng)時(shí)間肝臟缺血/再灌注+IL-22治療組(LT-IRI-IL-22)。肝臟IRI造模具體方法可參照[5]。短、中、長(zhǎng)時(shí)間缺血模型缺血時(shí)間分別為30、90和150 min。再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)(6、12、24和48 h)安樂(lè)死小鼠，獲取肝臟、血清等組織用于后續(xù)研究。

2.2 肝損傷檢測(cè)小鼠肝損傷分析通過(guò)檢測(cè)血清ALT、AST活性，測(cè)算肝指數(shù)(肝質(zhì)量/體質(zhì)量，LW/BW)以及HE病理染色分析等方法。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)應(yīng)用TRIzol法抽提肝臟RNA后，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR036A)操作說(shuō)明生成cDNA，最后利用SYBR green premix(康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)反應(yīng)體系定量PCR。引物序列如下，18S：For 5′-GTAAC CCGTTGAACCCCATT-3′, Rev 5′-CCATCCAATCGGT AGTAGCG-3′; IL-22Rα1：For 5′-TTACTACGCCAAG GTCACGG-3′，Rev 5′-GGCGGTTTGATGGTAGTGTG-3′; IL-22BP：For 5′-CGAGCTGTATTACGGGAGGG-3′，Rev 5′-CGGAGGATCTAGTTTTGTTTCCC-3′。

2.4 免疫印跡利用RIPA 組織裂解液獲取肝臟組織總蛋白，BCA法定量蛋白。取60 μg蛋白/樣本行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗、二抗孵育。其中一抗稀釋比例：p-STAT3(1 ∶2 000)，STAT3(1 ∶1 000)，cyclinD1(1 ∶1 000)。蛋白條帶定量分析應(yīng)用ImageJ v1.6.0軟件。

2.5 HE染色將獲取的部分肝臟組織固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切片(厚4 μm)，并對(duì)切片行HE染色[5]。簡(jiǎn)言之，肝組織切片依次浸入二甲苯(15 min/次×2次)、100%乙醇(5 min/次×2次)及95%、80%乙醇和水中(各5 min)。在蘇木精溶液和伊紅中各染色5 min、10 s，清洗后在不同濃度乙醇中浸泡后封片。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS軟件(v19.0)用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way ANOVA。

3 結(jié)果

3.1 肝臟缺血/再灌注損傷上調(diào)血清IL-22水平，誘導(dǎo)肝內(nèi)STAT3通路激活ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，同假手術(shù)組(Sham)相比，缺血/再灌注組(IRI，缺血90 min)在再灌注后6 h血清IL-22濃度明顯升高(Fig 1A)。Western blot檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，同Sham組比較，IRI組在再灌注后6 h肝組織p-STAT3蛋白表達(dá)增加明顯，表明缺血/再灌注損傷明顯誘導(dǎo)了肝內(nèi)STAT3通路的激活(Fig 1B，1C)。

3.2 不同缺血時(shí)間對(duì)再灌注后肝損傷的影響為了研究不同缺血時(shí)間對(duì)再灌注后肝損傷的影響，隨機(jī)將小鼠分為3組：短時(shí)間缺血/再灌注組(ST-IRI，缺血30 min)、中等時(shí)間缺血/再灌注組(MT-IRI，缺血90 min)及長(zhǎng)時(shí)間缺血/再灌注組(LT-IRI，缺血150 min)。研究顯示，同ST-IRI組相比，MT-IRI及LT-IRI組小鼠在再灌注后12 h血清ALT、AST活性明顯增加(Fig 2A，2B)，而在再灌注后6 h肝指數(shù)(肝重/體重)升高明顯，其中LT-IRI升高最為明顯(Fig 2C)。HE染色結(jié)果(Fig 2D)顯示, 在再灌注后12 h，同ST-IRI組相比，MT-IRI及LT-IRI組肝組織可見(jiàn)更大范圍的梗死灶及更多邊緣浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，表明在一定范圍內(nèi)，肝臟隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，在再灌注后表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的肝損傷。

Fig 1 Serum IL-22 level up-regulated and hepatic STAT3 pathway activated by liver

Fig 2 Effects of different ischemia time on liver injury after reperfusion

3.3 不同缺血時(shí)間對(duì)再灌注后血清IL-22及肝內(nèi)STAT3通路激活的影響ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同ST-IRI及MT-IRI組相比，LT-IR組小鼠在再灌注后6 h血清IL-22濃度升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ST-IRI與MT-IRI組差異并不明顯(Fig 3A)。PCR結(jié)果可見(jiàn)，同ST-IRI及LT-IRI組相比，MT-IR組在再灌注后6 h肝組織IL-22受體α1(IL-22Rα1)mRNA表達(dá)最少(Fig 3B)。Western blot結(jié)果可見(jiàn)同MT-IRI及LT-IRI組相比，ST-IR組在再灌注后6 h肝組織p-STAT3及cyclinD1蛋白表達(dá)增加明顯，提示ST-IRI組肝內(nèi)p-STAT3通路被明顯激活(Fig 3C，3D)。

3.4 不同缺血時(shí)間對(duì)再灌注后肝內(nèi)IL-22BP表達(dá)的影響利用PCR技術(shù)檢測(cè)肝內(nèi)IL-22BP mRNA表達(dá)情況，試圖揭示不同缺血時(shí)間對(duì)肝內(nèi)IL-22BP表達(dá)的影響。結(jié)果如圖Fig 4A所示，同IL-22Rα1 mRNA表達(dá)類(lèi)似，IL-22BP mRNA在MT-IRI組表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值不斷增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4B)。

3.5 外源性重組IL-22的治療減輕小鼠肝臟缺血/再灌注損傷為了更加直接的研究IL-22在肝臟IRI損傷中的作用，給予長(zhǎng)時(shí)間缺血組(LT-IRI)小鼠以外源性重組IL-22治療。給藥方法為手術(shù)前30 min尾靜脈注射(0.125 μg·g-1)。同LT-IRI相比，LT-IRI-IL-22小鼠在再灌注后6 h，血清IL-22濃度明顯增加(Fig 5A),同時(shí)肝損傷明顯減輕，表現(xiàn)為更低的血清ALT、AST活性和更輕微的組織學(xué)變化(Fig 5B-D)。Western blot結(jié)果同我們預(yù)期一致，即LT-IRI-IL-22組再灌注后6 h肝內(nèi)STAT3通路被明顯激活,表現(xiàn)為顯著增加的p-STAT3蛋白的表達(dá)(Fig 5E，5F)。

Fig 3 Effects of different ischemia time on serum IL-22 concentration and STAT3 pathway activation after reperfusion

Fig 4 Effect of different ischemia time on expression of IL-22BP in liver after reperfusion

Fig 5 The hepatic ischemia-reperfusion injury of mice treated with exogenous recombinant IL-22 significantly alleviated 6 h after reperfusion

4 討論

本研究中我們發(fā)現(xiàn)肝臟IRI能夠明顯升高血清IL-22水平并促進(jìn)肝內(nèi)STAT3通路的激活。相比ST-IRI組，MT-IRI和LT-IRI組表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的再灌注損傷。盡管再灌注后LT-IRI組血清IL-22濃度升高最為明顯，但其肝內(nèi)STAT3通路的激活卻被明顯抑制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，相比另外兩組，MT-IRI組肝臟IL-22Rα1和IL-22BP mRNA表達(dá)量均明顯減少，但3組的IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值卻隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯增加趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)給予外源性重組IL-22，遭受長(zhǎng)時(shí)間缺血/再灌注損傷的小鼠肝損傷明顯減輕，肝內(nèi)STAT3通路的激活也顯著上調(diào)。

IL-22在不同組織器官中的作用被陸續(xù)報(bào)道，然而對(duì)體內(nèi)誘導(dǎo)該細(xì)胞因子表達(dá)的研究仍然不足。有動(dòng)物研究報(bào)道顯示部分肝切除手術(shù)(partial hepatectomy, PHx)術(shù)后早期小鼠血清IL-22及肝組織IL-22R mRNA水平明顯升高[12]，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在藥物性肝損傷和急性失代償期肝硬化人類(lèi)患者血清及肝臟中也檢測(cè)出高水平的IL-22表達(dá)[13-14]，表明肝臟手術(shù)或損傷或可誘導(dǎo)內(nèi)源性IL-22產(chǎn)生。通過(guò)建立小鼠肝臟IRI模型，我們證實(shí)IRI可明顯升高小鼠血清IL-22濃度，進(jìn)一步研究顯示肝臟IRI后STAT3信號(hào)通路被明顯激活，這或許與IL-22產(chǎn)生增加有關(guān)。

IL-22BP是一種可溶性IL-22受體，缺乏跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[6]。近年來(lái)IL-22BP在肝臟中的作用逐漸引起研究者的重視。有研究報(bào)道，與IL-22類(lèi)似，在肝硬化患者血清中同樣檢測(cè)到升高的IL-22BP[9,13]。體外研究顯示，IL-22BP可顯著抑制IL-22誘導(dǎo)的Huh-7和HepG2細(xì)胞STAT3通路的激活，當(dāng)IL-22BP/IL-22濃度比值達(dá)到10或50或更高時(shí)，IL-22誘導(dǎo)的STAT3的激活可被完全阻斷[13]。高IL-22水平和低IL-22BP/IL-22比值與肝硬化患者慢性肝衰竭急性發(fā)作(acute-on-chronic liver failure, ACLF)及死亡率密切相關(guān)[13]。來(lái)自德國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)得出了類(lèi)似的結(jié)論，指出IL-22BP基因缺陷的小鼠對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷更加敏感，并且在接受APAP之后引起更為嚴(yán)重的肝損傷[15]。表明IL-22BP在不同類(lèi)型肝損傷中發(fā)揮作用，可能是通過(guò)抑制IL-22的活性實(shí)現(xiàn)的[16]。我們發(fā)現(xiàn)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織IL-22BP mRNA表達(dá)并沒(méi)有呈現(xiàn)增加或減少趨勢(shì)，而是表現(xiàn)為“兩頭高中間低”的趨勢(shì)，IL-22Rα1 mRNA表達(dá)趨勢(shì)與IL-22BP mRNA類(lèi)似。盡管如此，IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值卻隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-22BP與IL-22的親和力遠(yuǎn)高于膜受體，可通過(guò)阻止IL-22與膜受體的結(jié)合而起到抑制IL-22的作用[6]，這或許是IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值增加導(dǎo)致肝損傷不斷加重的原因之一。

IL-22在急性肝損傷時(shí)具有保肝作用，但在慢性肝損傷中的作用仍存在爭(zhēng)議，這種具有環(huán)境依賴性的雙刃劍作用取決于疾病類(lèi)型、發(fā)展階段及特定的組織微環(huán)境(尤其是內(nèi)源性調(diào)控IL-22活性的細(xì)胞因子)。但是，目前我們對(duì)此仍然知之甚少[17]。IL-22BP作為內(nèi)源性調(diào)控IL-22活性的重要因素之一，我們證實(shí)了IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值在肝臟缺血/再灌注損傷中的消極作用，對(duì)深入并豐富IL-22在肝損傷中的作用及為尋找新的、更為安全有效的保肝藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)以IL-22及其相關(guān)通路或調(diào)節(jié)蛋白為靶點(diǎn)的新治療措施奠定基礎(chǔ)。