內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體-Toll樣受體4信號(hào)途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化

化 維，朱嫚嫚，范璐璐，孫國(guó)平，劉加濤

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.藥劑科、2.腫瘤科，安徽 合肥 230022)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六常見(jiàn)的惡性腫瘤，占癌癥相關(guān)死因的第四位。更為棘手的是，在過(guò)去的幾十年中，肝癌的治療一直沒(méi)有突破。肝臟被認(rèn)為是人體獨(dú)特的免疫器官。肝臟微環(huán)境的慢性炎癥以及由病毒感染和代謝紊亂引起的免疫細(xì)胞功能異常對(duì)肝癌的發(fā)展具有重要影響[1]。從理論上講，免疫療法可能為肝癌的治療帶來(lái)新的突破。但是，目前的免疫療法在肝癌的治療中尚未取得令人滿(mǎn)意的突破。因此，迫切需要一種有效的肝癌治療方法。

惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)外的應(yīng)激壓力如異常增殖、缺血、缺氧等均可能導(dǎo)致大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]。研究表明，ERS相關(guān)基因或蛋白在多種實(shí)體瘤中異常激活，而ERS的持續(xù)激活與諸如肝癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸密切相關(guān)[3]。最近，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活的肝癌組織可以募集大量高表達(dá)免疫抑制分子的巨噬細(xì)胞[4]。巨噬細(xì)胞可分為具有抗腫瘤活性的經(jīng)典活化M1型和具有促腫瘤作用的替代活化M2型。有報(bào)道稱(chēng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加了肝細(xì)胞癌中GP73的分泌，GP73參與TAM表型有關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子的釋放[5]。這些結(jié)果表明，ERS可能與HCC微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的募集以及M2轉(zhuǎn)化有關(guān)，但其潛在機(jī)制仍不清楚。

外泌體是直徑為30-150 nm的細(xì)胞外囊泡，幾乎所有細(xì)胞都可分泌。研究表明，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)外泌體促使微環(huán)境中其他細(xì)胞“感知”腫瘤信號(hào)，促進(jìn)免疫和炎性細(xì)胞的表型和功能的變化，從而有利于腫瘤免疫逃逸[6]。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細(xì)胞在熱應(yīng)激、饑餓和缺氧等壓力下合成的一組高度保守的蛋白。HSP70是熱休克蛋白家族的重要成員，也是外泌體的表面標(biāo)志之一。最近的研究表明，外源性HSP70可以與抗原呈遞細(xì)胞上的Toll樣受體4結(jié)合，并起免疫調(diào)節(jié)作用[7]。TLR4是能夠與4種Toll樣-白介素受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的先天免疫受體，可啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，調(diào)控細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，是先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要介質(zhì)。研究表明，TLR4參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲和化療耐藥等過(guò)程，如TLR4可刺激結(jié)腸癌中IL-6和一氧化氮的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[8]。文獻(xiàn)報(bào)道[9]，激活樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)TLR4/NF-KB途徑，可以促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟和遷移。Karina等[10]發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，并且上調(diào)巨噬細(xì)胞中Toll 樣受體的表達(dá)，但宮頸癌細(xì)胞上清液促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化和TLR4上調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚。因此，我們推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肝癌細(xì)胞分泌的外泌體可能通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞表面TLR4受體，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

1 材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，以含10%胎牛血清(以色列BI公司)和1%的青霉素-鏈霉素(上海碧云天有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(以色列BI公司)在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。肝癌細(xì)胞隔天更換培養(yǎng)基，直至細(xì)胞融合到80%-90%左右用胰酶(上海碧云天有限公司)消化傳代，RAW264.7細(xì)胞每天更換培養(yǎng)基，吹打傳代。

1.2 主要試劑及儀器衣霉素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：T7765)；外泌體提取試劑盒(ExoQuick-TCTM)和無(wú)外泌體血清購(gòu)自于美國(guó)SBI公司(貨號(hào)：EXOTC50A-1、EXO-FBS-250A-1)；兔抗GRP78抗體購(gòu)自南京Bioworld有限公司(貨號(hào)：AA53131)；兔抗CD63、兔抗TSG101、兔抗Arg-1和兔抗TGF-β1購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab217345、ab125011、ab60176、ab92486)；兔抗Calnexin、兔抗HSP70、鼠抗β-actin、鼠抗GAPDH購(gòu)自于美國(guó)Cell Signaling Technology公司(貨號(hào)：#2679、#4873、#3700、#5174，)；DAPI染核液購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；小鼠炎癥因子CBA試劑盒購(gòu)自于美國(guó)BD Biosciences公司(貨號(hào)：5008944)；抗鼠FITC-F4/80、抗鼠PE-CD206和抗鼠TLR4購(gòu)自于美國(guó)BioLegend公司(貨號(hào)：#123115、Clone C068C2、#145403)；PKH67 熒光細(xì)胞膜標(biāo)記試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：SLBM4309V)；Image Quant LAS 4000發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司；FC500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman coulter公司；M450酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

2 方法

2.1 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系或RAW264.7細(xì)胞，接種到六孔板中，培養(yǎng)貼壁12h以后，根據(jù)各試驗(yàn)?zāi)康姆謩e處理。收集各處理組的細(xì)胞，PBS清洗3遍，加入適量含1% PMSF(蛋白酶抑制劑)的蛋白裂解液冰上裂解30 min，以12 000 r·min-1離心10 min，取蛋白上清，加入5× Loading buffer混勻，沸水中煮10-15 min，再用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。向聚丙烯酸凝膠中加入20-30 μg每孔的樣品，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別與相應(yīng)的一抗(如β-actin抗體、GRP78抗體、HSP70抗體、CD63抗體、Arg-1抗體、TGF-β1抗體、TSG101抗體和Calnexin抗體，稀釋比例均為1 ∶1 000)孵育過(guò)夜。TBST洗膜3遍，二抗室溫敷育1 h后TBST洗膜3次，Image Quant LAS 4000發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

2.2 外泌體的提取分別收集TM誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激前后HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞的培養(yǎng)上清，3 000 r·min-1離心15 min去除細(xì)胞碎片。使用外泌體提取試劑盒(ExoQuick-TCTM)分離正常培養(yǎng)肝癌細(xì)胞上清中的外泌體(Exo-con)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體(Exo-TM)，并通過(guò)透射電鏡和蛋白印跡試驗(yàn)対收集的外泌體進(jìn)行鑒定。

2.3 電鏡將純化的外泌體從冰箱中取出并在冰上自然融化，取10 μL純化的Exo-con和Exo-TM添加到銅網(wǎng)中，室溫靜置3 min，然后以2%磷鎢酸復(fù)染3 min。最后，用PBS清洗銅網(wǎng)，并在室溫下自然晾干，使用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)。

2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)所有肝癌和正常肝組織均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋和去石蠟。經(jīng)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和抗原修復(fù)等操作之后，將切片與GRP78一抗孵育過(guò)夜。濕盒中取出切片，洗滌，與二抗共孵育。最后，用二氨基聯(lián)苯胺染色，并使用蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。通過(guò)將染色強(qiáng)度乘以染色細(xì)胞的百分比對(duì)GRP78的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分[4]。

2.5 免疫熒光檢測(cè)用PKH67標(biāo)記肝癌細(xì)胞分泌的外泌體，加入RAW264.7培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)12 h后，用0.5% Triton-100破膜10 min，用預(yù)冷的PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，再次清洗3遍后，DAPI染核5 min，PBS清洗兩遍，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)將RAW264.7細(xì)胞與Exo-con和Exo-TM(10 mg·L-1)共同孵育24 h，然后收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌，離心并重懸，并加入適量Biolegend公司的抗鼠FITC-F4/80、抗鼠PE-CD206或抗鼠PE-TLR4(貨號(hào)：123107、117605、141705)。孵育45 min后，以含有1% BSA的預(yù)冷PBS洗滌2次，重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FlowJo10.5.4軟件(Tree Star，Inc.)進(jìn)行分析。

2.7 細(xì)胞因子檢測(cè)使用“2.6”步所得的細(xì)胞上清液與CBA試劑盒室溫共同孵育4 h，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Exo-con和Exo-TM對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6和IL-10表達(dá)水平的影響。

2.8 Affymetrix基因芯片篩選差異表達(dá)的mRNA和生物信息學(xué)分析通過(guò)Affymetrix基因芯片對(duì)Exo-con和Exo-TM處理后巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析。過(guò)程簡(jiǎn)述如下：使用TRIzol提取Exo-con和Exo-TM處理后巨噬細(xì)胞的總RNA，使用T7 Oligo(dT)引物與第一鏈酶混合，合成cDNA第一鏈。然后，利用第二鏈酶混合物合成cDNA第二鏈和雙鏈cDNA，并使用有機(jī)溶劑提純雙鏈cDNA，再使用T7酶混合液并加入生物素體外合成cDNA。最后，對(duì)合成的RNA進(jìn)行純化、定量和片段化，并將片段化的cRNA與Affymetrix芯片雜交。利用KEGG Orthology Based Annotation系統(tǒng)對(duì)不同mRNAs的Gene Ontology(GO)生物學(xué)過(guò)程特征和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 衣霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激首先使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)構(gòu)建肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。Western blot分析表明，TM可劑量(0、1.25、2.5和5.0 μmol·L-1)依賴(lài)性增加ERS標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)(Fig 1A，1B)。然而，相比于2.5 μmol·L-1組，5.0 μmol·L-1濃度的TM并沒(méi)有顯著提高GRP78蛋白的表達(dá)水平(Fig 1A，1B)。隨后，我們使用2.5 μmol·L-1的TM刺激HepG2細(xì)胞不同時(shí)間(0、12、24和48 h)，發(fā)現(xiàn)GRP78的表達(dá)與TM刺激時(shí)間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但24與48 h組無(wú)差異(Fig 1C，1D)。上述結(jié)果表明，2.5 μmol·L-1衣霉素作用24 h可以在HCC細(xì)胞中建立合適的ERS模型。此外，Western blot檢測(cè)4對(duì)肝癌組織和相應(yīng)的非癌性肝組織標(biāo)本GRP78的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織表達(dá)的GRP78蛋白水平更高(Fig 1E)，免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果(Fig 1F)。

Fig 1 ER stress in liver cancer cells activated by tunicamycin

Fig 2 Exosomes efficiently incorporated by macrophages

3.2 巨噬細(xì)胞可有效地?cái)z取肝癌細(xì)胞釋放的外泌體透射電子顯微鏡(TEM)顯示分離到的沉淀物呈圓形或類(lèi)圓形的雙層囊泡結(jié)構(gòu)，符合典型的外泌體形態(tài)學(xué)特征，并且Exo-TM組(Fig 2A)中囊泡的直徑較Exo-con組(Fig 2B)更大。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，這些圓形囊泡表達(dá)跨膜蛋白CD63、TSG101和熱休克蛋白70(HSP70)外泌體標(biāo)志蛋白，且不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Calnexin，表明提取的囊泡是外泌體(Fig 2C)。值得注意的是，與Exo-con相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肝癌細(xì)胞分泌的外泌體攜帶更多的HSP70(Fig 2C)。此外，我們使用PKH67標(biāo)記外泌體，并將這些PKH67標(biāo)記的外泌體與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，激光共聚焦顯微鏡觀察RAW264.7可以有效地?cái)z取PKH67標(biāo)記的外泌體(Fig 2D，2E)。

3.3 Exo-TM促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型為了探索ERS的HCC細(xì)胞能否通過(guò)傳遞外泌體影響巨噬細(xì)胞極化。FCM發(fā)現(xiàn)，與Exo-con相比，HepG2分泌的Exo-TM與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h可以顯著地增加CD206的表達(dá)(Fig 3A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hep3B細(xì)胞來(lái)源的Exo-TM作用RAW264.7細(xì)胞也得到相似的結(jié)果(Fig 3B)。通過(guò)Western blot分析還發(fā)現(xiàn)，與Exo-con處理的RAW264.7細(xì)胞相比，Exo-TM處理的巨噬細(xì)胞Arg-1(P<0.05)和TGF-β1(P<0.01)蛋白水平明顯上調(diào)(Fig 3C)。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激HepG2和Hep3B釋放的外泌體不僅可顯著升高RAW264.7細(xì)胞的IL-6的表達(dá)水平，而且還可以提高IL-10表達(dá)(Fig 3D，3E)。上述證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞可通過(guò)分泌外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

3.4 Exo-TM上調(diào)巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)為進(jìn)一步探討Exo-TM促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化的具體機(jī)制，我們分別使用Exo-con和Exo-TM與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。通過(guò)Affymetrix基因芯片檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)與Exo-con組相比，Exo-TM作用后巨噬細(xì)胞中分別有129個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和123個(gè)基因下調(diào)(Fig 4A)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因與TLR級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)系最為密切，如TLR6-TLR2級(jí)聯(lián)反應(yīng)、TLR1-TLR2級(jí)聯(lián)反應(yīng)、MYD88和TLR4信號(hào)通路等(Fig 4B)。雖然多數(shù)研究認(rèn)為，TLR4通路活化可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1轉(zhuǎn)化，但近年來(lái)已在多個(gè)腫瘤中發(fā)現(xiàn)TLR4活化也可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2b表型轉(zhuǎn)化[11]。因此，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Exo-TM介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞M2極化是否也伴隨著TLR4信號(hào)途徑的激活。我們將HepG2細(xì)胞或Hep3B細(xì)胞中富含HSP70的外泌體與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)Exo-con和Exo-TM都可以明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞上TLR4的表達(dá)，并且在HepG2細(xì)胞內(nèi)Exo-TM使TLR4表達(dá)增加的程度比Exo-con組更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 4C和4D。上述證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞可能通過(guò)釋放外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Fig 3 Macrophages transformed to M2 phenotype promoted by Exo-TM

4 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在多種腫瘤中激活，并與基因組不穩(wěn)定性、血管生成和細(xì)胞化學(xué)抵抗等多種惡性生物學(xué)行為有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的樹(shù)突狀細(xì)胞上調(diào)促炎因子和免疫抑制酶的產(chǎn)生，并抑制其將抗原交叉呈遞給CD8+T細(xì)胞的能力[12]，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促腫瘤表型轉(zhuǎn)化[13]。因此，靶向ERS有望成為腫瘤免疫治療的新策略。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的HCC細(xì)胞釋放的外泌體可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化(Fig 3)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的HCC細(xì)胞可以釋放出更多的富含HSP70的外泌體，蛋白質(zhì)譜分析也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果(未發(fā)表)。HSP70被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最重要的HSPs，也是研究最深入的HSPs家族，在協(xié)同免疫中起著重要的作用。一些研究者在黑色素瘤小鼠模型使用結(jié)核分枝桿菌衍生的細(xì)胞外DnaK(哺乳動(dòng)物Hsp70的細(xì)菌直系同源物)，發(fā)現(xiàn)它可以通過(guò)IL-10/IL-10R信號(hào)通路促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的極化[14]，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)外泌體中攜帶的HSP70可能與巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)。

TLR4的表達(dá)與肝癌的預(yù)后不良和患者的整體生存有關(guān)。有研究報(bào)道，腫瘤微環(huán)境可以通過(guò)TLR4依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，TLR4可能是巨噬細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種傳感器[15]。因此，推測(cè)ERS相關(guān)的外泌體通過(guò)激活巨噬細(xì)胞TLR4途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可有效地?cái)z取外泌體，并明顯增加巨噬細(xì)胞上TLR4的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化(Fig 3、4)。紫杉醇可通過(guò)TLR4依賴(lài)性途徑將M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞重新編程為M1型，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布。我們的研究表明，肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面TLR4水平并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，這與Toll 樣受體的激活可以促進(jìn)結(jié)腸癌移植瘤小鼠巨噬細(xì)胞M1轉(zhuǎn)化以及抑制腫瘤等文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相反，表明TLR4在不同環(huán)境下可能發(fā)揮不同的作用[16]。正因?yàn)門(mén)LR4受體的雙重免疫調(diào)控作用，越來(lái)越多的制藥公司正在開(kāi)發(fā)TLR4拮抗劑如類(lèi)似于脂多糖結(jié)構(gòu)的厄里特蘭[17]，其通過(guò)抑制Toll樣受體活性，調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫效應(yīng)。此外，vega等[18]發(fā)現(xiàn)，與重組HSP70相比，外泌體中HSP70在激活巨噬細(xì)胞的過(guò)程中表現(xiàn)出強(qiáng)而特異性的特征，這與我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，見(jiàn)Fig 3。然而ERS相關(guān)外泌體被巨噬細(xì)胞攝取后，能否提供其攜帶的HSP70，上調(diào)巨噬細(xì)胞表面TLR4受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，還需要進(jìn)一步探討。

Fig 4 TLR4 expression in macrophages up-regulated by Exo-TM

綜上所述，本研究結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肝癌細(xì)胞分泌的外泌體富含HSP70，這些外泌體可能通過(guò)激活巨噬細(xì)胞中的TLR4途徑來(lái)增強(qiáng)炎癥因子的分泌并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型的轉(zhuǎn)化，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。我們的結(jié)果豐富了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)肝癌細(xì)胞免疫逃逸的認(rèn)識(shí)，并為通過(guò)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、外泌體和巨噬細(xì)胞治療肝細(xì)胞癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。