柚皮素促進(jìn)Nrf2/Ⅱ相解毒酶活性并降低血管炎癥反應(yīng)

董豆豆，張 蕓，何 慧，雷霆雯，歐海龍

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025)

柚皮素(naringenin)即4′, 5, 7-三羥基黃烷酮(4′, 5, 7-trihydroxyflavanone)屬于二氫黃酮類化合物，是柑橘屬植物的次生代謝產(chǎn)物。柚皮素作為柚皮苷的苷元，廣泛存在于檸檬、橘子、胡柚等天然產(chǎn)物的果皮和果肉中。柚皮素具有消炎、抗氧化等多種生物學(xué)、藥理學(xué)活性[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，柚皮素對于多種疾病，如糖尿病、肥胖、高血壓癌癥、神經(jīng)退化、腎損傷等具有良好的預(yù)防和保護(hù)作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素還可以改善血脂，降低肝臟脂質(zhì)積累，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[4]。

藥物以及其他的外源性物質(zhì)在體內(nèi)代謝過程中，經(jīng)過氧化、還原及水解等第一相反應(yīng)外，經(jīng)常還要與極性更強(qiáng)的葡萄糖醛酸、硫酸等結(jié)合，提高溶解度，即第二相反應(yīng)，參與反應(yīng)的酶統(tǒng)稱為Ⅱ相解毒酶。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是應(yīng)激誘導(dǎo)的的轉(zhuǎn)錄因子，在維護(hù)機(jī)體氧化還原平衡過程中起著關(guān)鍵作用[5]。在細(xì)胞的正常狀態(tài)時(shí)，無活性的Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)結(jié)合而被泛素化并降解；細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生時(shí)，Nrf2被釋放、移入核內(nèi)，與DNA上的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]。藥物代謝過程中的Ⅱ相解毒酶如NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase1，NQO-1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)等均受Nrf2調(diào)控[5]。

動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體炎癥關(guān)系密切。在病變早期，多余脂質(zhì)以氧化的低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein，ox-LDL)形式沉積在血管壁，誘發(fā)血管炎癥，使單核/巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜間隙遷移，促進(jìn)斑塊的形成。在病變末期，血管炎癥降低斑塊的纖維帽、使斑塊不穩(wěn)定。所以，降低血管炎癥可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。本研究擬分析柚皮素對Nrf2介導(dǎo)的Ⅱ相解毒酶活性的調(diào)節(jié)作用；同時(shí)利用載脂蛋白E(apolipoprotein,apoE)基因敲除的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠(apoE-/-)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分析柚皮素對主動(dòng)脈血管炎癥的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購于中科院細(xì)胞庫(貨號(hào)：TCM13)；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco(批號(hào)：8120206)；血清購于杭州四季青公司(批號(hào)：20090301)；NQO-1(批號(hào)：00091222)、GST(批號(hào)：00056400)、GCLc(批號(hào)：00091423)和GCLm(批號(hào)：00091314)等抗體購自武漢三鷹公司、各種酶活性檢測試劑盒購自南京建成公司；ECL發(fā)光液(貨號(hào)：P0018M)購自江蘇碧云天公司；apoE-/-小鼠(貨號(hào)：J002052)購置于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；其他生物試劑使用國產(chǎn)試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長70%左右融合度時(shí)，進(jìn)行分組，并分別處理24 h：用50 mg·L-1, ox-LDL孵育，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楹芍?xì)胞[6]；ox-LDL(50 mg·L-1)與不同濃度柚皮素(10 μmol·L-1和50 μmol·L-1)共同孵育；ox-LDL(50 mg·L-1)、柚皮素(50 μmol·L-1)以及Nrf2抑制劑ML385(5 μmol·L-1)共同孵育。

1.3 小鼠處理ApoE-/-小鼠飼養(yǎng)于(20±2)℃、相對濕度40%-70%、自然晝夜采光環(huán)境中，將6周齡、體質(zhì)量為(18-20)g的小鼠進(jìn)行高脂肪飼料喂養(yǎng)(21%脂肪和0.15%膽固醇)，其中一部分進(jìn)行80 mg·kg-1柚皮素喂養(yǎng)8周；另外一組在柚皮素誘導(dǎo)的過程中，通過腹腔注射ML385(10 mg·kg-1)，兩天一次，處理兩周。

1.4 Ⅱ相酶含量和活性檢測NQO-1含量的檢測通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒進(jìn)行；GST和GCL活性檢測通過酶活性試劑盒進(jìn)行。均按照南京建成生物工程研究所提供的操作步驟進(jìn)行。以Biotek Epoch微孔板分光光度計(jì)(Biotech)測定相應(yīng)指標(biāo)的吸光度值。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)細(xì)胞或組織冰上裂解后，通過BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白于10% SDS-PAGE 蛋白電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉2 h后，相繼進(jìn)行一抗、二抗孵育，最后將膜用TBST充分洗滌，并加入ECL發(fā)光液，在Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)獲取圖像。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)獲取血管組織，用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。用β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算各目的基因相對于內(nèi)參的表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞免疫熒光取6-8 μm的主動(dòng)脈根部冰凍切片，經(jīng)丙酮固定后，進(jìn)行0.2%Triton X-100(磷酸鹽緩沖液配制)通透處理。封閉之后，分別用鼠抗白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和鼠抗單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)孵育過夜，再與熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，經(jīng)洗滌、封片之后，在倒置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察、采集圖像。

1.8 免疫共沉淀將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)各種相應(yīng)的處理后進(jìn)行裂解，并將預(yù)先洗好的蛋白A/G瓊脂糖珠子、抗Keap-1一抗加入到裂解液中，于4 ℃搖轉(zhuǎn)孵育2-3 h，進(jìn)行免疫沉淀?；旌衔镉? ℃ 3 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞裂解液洗滌3次，棄去上清。最后加入25-50 μL 2×SDS 上樣緩沖液重懸，沸水煮5 min，游離抗原、抗體和珠子。再于4 ℃、10 000 r·min-1離心1 min，收集上清，取20 μL樣品進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素激活Nrf2 活性對RAW264.7細(xì)胞分別進(jìn)行ox-LDL處理、ox-LDL和不同濃度柚皮素共處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL促進(jìn)核內(nèi)Nrf2的水平，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2含量并沒有明顯增加。而10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的柚皮素均可進(jìn)一步提高核內(nèi)Nrf2，其中50 μmol·L-1的柚皮素處理的細(xì)胞中的Nrf2水平比單獨(dú)ox-LDL處理的細(xì)胞的Nrf2水平提高了1.25倍(Fig 1A, B)。同時(shí)，免疫共沉淀結(jié)果顯示，柚皮素降低Nrf2與Keap1的結(jié)合(Fig 1C)。該結(jié)果說明，柚皮素促進(jìn)其核內(nèi)轉(zhuǎn)移，激活Nrf2。

2.2 柚皮素促進(jìn)Ⅱ相解毒酶的表達(dá)分別對RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理：ox-LDL(50 mg·L-1)、ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)以及ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)+ ML385。對直接受控于Nrf2的Ⅱ相解毒酶NQO-1、GST、GCLc催化亞基(GCLc)以及GCL調(diào)節(jié)亞基(GCLm)的表達(dá)進(jìn)行檢測，Western blot結(jié)果顯示與單獨(dú)的ox-LDL處理組相比，柚皮素(50 μmol·L-1)提高了上述解毒酶的蛋白水平(Fig 2)。另外，利用Nrf2抑制劑ML385對細(xì)胞進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)ML385均能明顯降低NQO1、GST、GCLc和GCLm的表達(dá)(Fig 2)，說明柚皮素可能通過Nrf2的作用，參與對Ⅱ相解毒酶的調(diào)節(jié)。

2.3 柚皮素抑制ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步分析柚皮素在細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示，ox-LDL明顯提高IL-6、MCP-1、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白水平，而柚皮素降低這些炎癥因子表達(dá)(Fig 3)；ML385處理破壞柚皮素的作用，促進(jìn)炎癥因子IL-6、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的產(chǎn)生(Fig 3)，說明柚皮素的抑制炎癥作用與Nrf2的活化有關(guān)。

Fig 1 Nrf2 nuclear accumulation in RAW264.7 cells promoted by naringenin n=3)

2.4 柚皮素促進(jìn)肝臟Ⅱ相解毒酶的活性對apoE小鼠進(jìn)行高脂飲食(high fat diet, HFD)、HFD+柚皮素以及HFD+柚皮素+ML385處理后，發(fā)現(xiàn)HFD小鼠中肝臟的NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的蛋白表達(dá)均明顯提高；柚皮素進(jìn)一步促進(jìn)這些Ⅱ相解毒酶的蛋白含量(Fig 4A)。而Nrf2抑制劑ML385則明顯降低小鼠肝臟NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的水平(Fig 4A)。進(jìn)一步我們通過ELISA對肝臟內(nèi)NQO-1含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)柚皮素提高了1.75倍(0.28 μg·g-1vs0.77 μg·g-1)；而ML385處理組與柚皮素組相比，降低了60%(0.31 μg·g-1vs0.77 μg·g-1)(Fig 4B)。同時(shí)，對GST、GCL兩種酶的活性進(jìn)行檢測我們獲得相似的結(jié)果，即HFD和柚皮素均提高這兩種酶的活性，而ML385則對這些酶的活性有抑制作用(Fig 4C,D)。

Fig 2 The promoting effect of naringenin on phase Ⅱ detoxifying enzymes mediated by Nrf2 in RAW264.7 cells n=3)

2.5 柚皮素抑制血管炎癥對不同處理小鼠的主動(dòng)脈血管炎癥進(jìn)行分析，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，柚皮素抑制HFD誘導(dǎo)的IL-6、MCP-1的表達(dá)，而ML385處理則消除這種抑制作用，使IL-6和MCP-1的表達(dá)上調(diào)(Fig 5A，B)。最后，我們利用RT-qPCR對血管炎癥介質(zhì)的mRNA水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MCP-1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-18、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素(E-selectin)的表達(dá)均受柚皮素抑制，而且也被ML385所激活(Fig 5C)。該結(jié)果說明，柚皮素通過調(diào)節(jié)Nrf2的活性抑制體內(nèi)主動(dòng)脈血管的炎癥。

Fig 3 Protein levels of IL-6, MCP-1,VCAM-1 and ICAM-1 in RAW264.7 cells n=3)

Fig 4 Protein levels and activities of NQO-1, GST, GCLc and GCLm in livers

Fig 5 Vascular inflammation at aortic root in apoE-/- mice n=8)

3 討論

本研究證實(shí)柚皮素激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化以及Ⅱ相解毒反應(yīng)，通過該調(diào)控作用抑制血管炎癥因子的產(chǎn)生。柚皮素之前已被證明在降低細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激中具有重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可抑制6-羥多巴胺誘導(dǎo)的線粒體損傷、防止神經(jīng)退化Kesh；柚皮素對于各種殺蟲誘導(dǎo)的毒性均有較好的抑制作用[7]。另外，柚皮素還可以緩解CCl4、砷、鎘、鉛和鐵引起的細(xì)胞毒性[8-12]。而且人們發(fā)現(xiàn)柚皮素的解毒效果與其抑制氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。本研究中，我們進(jìn)一步證實(shí)柚皮素還可以直接促進(jìn)Ⅱ相反應(yīng)，特別是提高NQO-1活性降低機(jī)體炎癥，參與細(xì)胞調(diào)控作用。NQO-1酶是一種典型的Ⅱ相酶，屬于黃素酶，可催化醌類物質(zhì)從NAD(P)H接受雙電子，而被還原為活性更低的氫醌類化合物，從而參與醌及其衍生物的解毒反應(yīng)。這為我們對柚皮素的藥理作用研究提供一個(gè)新的方向。

Ⅱ相解毒反應(yīng)主要是藥物、激素以及其他外源性物質(zhì)如食品添加劑等經(jīng)過第一相反應(yīng)，特別是在細(xì)胞色素P450氧化酶為主的氧化反應(yīng)之后，再與極性分子如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽等的結(jié)合反應(yīng)，降低活性、增強(qiáng)極性并順利排出體外。其中的Ⅱ相酶除了NQO-1外，我們還證明柚皮素可調(diào)控GCL、GST的活性。GCL包含GCL催化亞基(GCLc)和GCL調(diào)節(jié)亞基(GCLm)，是谷胱甘肽合成的限速酶。GST催化谷胱甘肽與底物結(jié)合，使其極性和水溶性增加。除此之外，在Ⅱ相酶中，還有UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、硫酸轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase，SULT)、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase，NAT)等，分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)葡萄糖醛酸、硫酸根和乙酰基的結(jié)合。本研究中，我們只對Nrf2關(guān)系比較密切的NQO1、GCL和GST進(jìn)行分析，而柚皮素是否通過UGT、NAT和SULT等改善細(xì)胞生理狀況，還需要進(jìn)一步研究。

Nrf2在機(jī)體的抗氧化還原反應(yīng)中起中心位置。當(dāng)機(jī)體活性氧如超氧陰離子自由基、過氧化氫以及羥自由基等增加，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2被活化，進(jìn)入核內(nèi)促進(jìn)具有ARE元件的基因轉(zhuǎn)錄。除了NQO-1和GSH-ST外，機(jī)體中抗氧化還原的因子如血紅素加氧酶 1(hemeoxygenase1，HO-1)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、硫氧還蛋白(thioredoxin)等均受Nrf2的調(diào)控[5]。本研究中，我們證實(shí)柚皮素可活化Nrf2，我們推測柚皮素還可能通過Nrf2調(diào)控這些氧化應(yīng)激相關(guān)因子，即聯(lián)合抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)Ⅱ相解毒酶活性共同作用，抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生過程中，過量的ox-LDL在血管壁的沉積是一個(gè)重要的事件，由此觸發(fā)血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。之前人們報(bào)道過柚皮素可以降低單核/巨噬細(xì)胞黏附，降低血脂、抑制機(jī)體抗炎，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[14-16]，本研究則從另外一個(gè)角度，即Nrf2介導(dǎo)的Ⅱ相解毒酶的活性調(diào)控上分析其抗炎作用和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，將體內(nèi)代謝調(diào)控與抗炎作用進(jìn)一步聯(lián)系起來。

總之，本研究證實(shí)柚皮素上調(diào)Nrf2活性，促進(jìn)下游與Ⅱ相解毒酶相關(guān)的分子如NQO-1、GCL和GST的表達(dá)，從而降低血管炎癥。這使我們對柚皮素的藥理作用有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也促進(jìn)人們對柚皮素的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的了解。