吉西他濱增強(qiáng)HUVEC疫苗抗胰腺癌作用實(shí)驗(yàn)研究

周 玲，楊 晨，高 艷，趙曉雨，徐茂磊

(1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東國際生物科技園發(fā)展有限公司，山東 煙臺(tái) 264670)

胰腺癌是消化道腫瘤中惡性程度極高的一種，其解剖位置的特殊性導(dǎo)致早期癥狀不明顯、病情惡變快、預(yù)后極差，且在癌癥早期就發(fā)生轉(zhuǎn)移，80%的胰腺癌患者確診時(shí)已失去手術(shù)切除的時(shí)機(jī)，所以胰腺癌的非手術(shù)治療在延長胰腺癌患者生命、改善患者預(yù)后方面起著重要作用[1-2]。內(nèi)科藥物治療是胰腺癌患者主要的非手術(shù)治療手段，包括化療和靶向治療。然而，化療藥物毒副作用大，而現(xiàn)有的分子靶向藥物如吉非替尼、厄洛替尼等很容易產(chǎn)生耐藥，因此臨床上亟需探索新的胰腺癌治療藥物。

隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展及對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，腫瘤疫苗已成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一。腫瘤疫苗即利用腫瘤抗原，通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)以抑止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的目的[3]。我們前期對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)疫苗進(jìn)行了持續(xù)研究，證實(shí)HUVEC疫苗可以誘發(fā)特異性的靶向腫瘤新生血管的免疫應(yīng)答，通過阻斷血管新生可以產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)。但跟其它抗原形式的腫瘤疫苗面臨類似的問題，即HUVEC疫苗雖然在預(yù)防性免疫中顯示了良好的抗腫瘤作用，但其在治療性免疫中的抗腫瘤作用仍有待提升[4-7]。

吉西他濱(gemcitabine，GEM)是一種脫氧嘧啶類似物，可通過抑制細(xì)胞DNA的合成以發(fā)揮抗腫瘤作用，已廣泛應(yīng)用于胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的臨床治療[8]。研究證實(shí)低劑量GEM可以降低細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK細(xì)胞)培養(yǎng)體系中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，提高CIK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[9]。含有GEM的胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基能有效刺激樹突狀細(xì)胞成熟，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)抗腫瘤免疫應(yīng)答[10]，這都提示我們小劑量GEM可以提升疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將小劑量GEM引入HUVEC疫苗方案，以Pan02胰腺癌作為研究對(duì)象，考察小劑量GEM能否提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗胰腺癌作用，并研究可能的機(jī)制，為優(yōu)化HUVEC疫苗臨床治療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物和細(xì)胞株 ♂ C57BL/6小鼠，4-5周齡，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003，SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，符合濱州醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)認(rèn)可；Pan02小鼠胰腺癌細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于5% CO2培養(yǎng)箱于37 ℃條件下培養(yǎng)。HUVEC細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，使用ECM內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱于37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.1.2試劑 注射用鹽酸吉西他濱購自江蘇南京正大天晴制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20093403)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30809.01)、胰酶消化液(貨號(hào):SH30042.01)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號(hào)：11011-8611)購自杭州四季青試劑有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)用青/鏈霉素混合液(貨號(hào)：P1400)、TMB單組分顯色液(貨號(hào)：PR1200)，購自北京索萊寶科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA，貨號(hào)：C7642)購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗小鼠IgG抗體(貨號(hào)：ZB2305)購自北京中杉金橋生物科技有限公司；CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：G1780)購自美國Promega公司；小鼠IFN-γ檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SEA049Ra)購自武漢云克隆科技股份有限公司；其它試劑均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1荷瘤小鼠模型的建立及分組 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：PBS對(duì)照組，GEM組，HUVEC疫苗組和GEM與HUVEC疫苗聯(lián)合(HUVEC-GEM)組。收集對(duì)數(shù)生長期的Pan02小鼠胰腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109個(gè)·L-1，于小鼠左肋皮下接種0.1 mL(接種量為5×105細(xì)胞/小鼠)。在接種后的d 2、8、14皮下注射0.1 mL HUVEC疫苗(含1×106HUVEC)，吉西他濱組于腫瘤接種后d 1、7、13腹腔注射100 μL GEM，使用劑量為30 mg·kg-1，HUVEC-GEM組腹腔注射100 μL GEM并且皮下注射100 μL的HUVEC疫苗，陰性對(duì)照組皮下注射100 μL PBS。待腫瘤成瘤后隔天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長徑和寬徑，腫瘤體積按V=0.52×長徑×寬徑2計(jì)算，接種腫瘤后的d 18處死所有小鼠，剝?nèi)∧[瘤并稱重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%，并將剖取的腫瘤組織切片，HE染色后作病理分析。各組小鼠處死前眼眥靜脈叢取血分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)過程中，觀察小鼠的日常行為活動(dòng)、毛發(fā)以及飲食情況等，并每周稱量小鼠體質(zhì)量，以評(píng)估小鼠整體健康狀況。

1.2.2免疫血清中HUVEC抗體檢測(cè) 用反復(fù)凍融的HUVEC裂解物作為包被抗原，將其溶解在pH 9.6碳酸鹽緩沖液中，以100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板，置于4 ℃冰箱中過夜。使用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL 1 ∶50倍稀釋的免疫血清，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每孔加入1 ∶10 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，使用TMB顯色液室溫避光顯色20 min，用4 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下吸光度值。

1.2.3淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按治療性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫結(jié)束后7 d，脫頸處死各組小鼠，無菌分離小鼠脾臟，研磨過200目篩網(wǎng)，PBS洗滌重懸，加入等量的紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心取沉淀，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010·L-1，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種，每孔接種100 μL(1×105細(xì)胞)，每組脾細(xì)胞中分別加入空白1640培養(yǎng)基、5 mg·L-1ConA、100 mg·L-1的HUVEC裂解物，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，避光孵育1-2 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下吸光度值。

1.2.4CTL殺傷活性實(shí)驗(yàn) 脾淋巴細(xì)胞懸液制備同1.2.3部分，使用美國Promega公司CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CTL細(xì)胞殺傷活性。各組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HUVEC裂解物刺激2 d后作為效應(yīng)細(xì)胞使用，取對(duì)數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞和Pan02細(xì)胞作為靶細(xì)胞。按照200 ∶1，100 ∶1，50 ∶1，25 ∶1的效靶比將脾淋巴細(xì)胞和HUVEC或Pan02細(xì)胞共培養(yǎng)于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)置相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照組，37 ℃共孵育4 h，吸取50 μL培養(yǎng)上清至96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入50 μL檢測(cè)試劑，室溫避光孵育30 min，每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀讀取490 nm波長下吸光度值，釋放率按下列公式計(jì)算：釋放率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD490-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)OD490-靶細(xì)胞自發(fā)OD490)/(靶細(xì)胞最大OD490-靶細(xì)胞自發(fā)OD490)×100%。

1.2.5小鼠血清中IFN-γ檢測(cè) 按治療性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫結(jié)束后7 d，眼眥靜脈叢取血分離各組血清，按照小鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組小鼠血清中IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗抗胰腺癌作用如Fig 1所示，PBS組小鼠腫瘤生長迅速，腫瘤生長曲線較陡直，HUVEC、GEM及HUVEC-GEM治療均在一定程度上延緩了腫瘤生長，其中HUVEC-GEM治療抑制腫瘤生長的作用最顯著。接種Pan02胰腺癌細(xì)胞18 d后PBS組腫瘤體積達(dá)到(1321.12±398.12)mm3，GEM、HUVEC和GEM+HUVEC組腫瘤體積分別為(1 058.52±327.08)mm3、(892.19±287.52)mm3及(575.33±128.37)mm3。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖取的腫瘤瘤重結(jié)果與腫瘤體積結(jié)果一致，HUVEC-GEM組平均瘤質(zhì)量明顯低于HUVEC組及GEM單藥組(P<0.05vsHUVEC,P<0.01vsGEM)，各組瘤質(zhì)量分別為PBS:(1.01±0.11)g，GEM:(0.84±0.12)g，HUVEC:(0.65±0.17)g，HUVEC-GEM:(0.44±0.10)g。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GEM的引入增強(qiáng)了HUVEC疫苗的抗腫瘤生長作用。

2.2 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞壞死為進(jìn)一步研究GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗的抗胰腺癌藥效學(xué)，我們對(duì)剖取的腫瘤進(jìn)行切片后HE染色分析，光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 2所示，PBS組腫瘤細(xì)胞生長活躍，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，未發(fā)現(xiàn)明顯的壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。GEM、HUVEC及HUVEC-GEM組均出現(xiàn)了一定程度的細(xì)胞壞死，伴隨核固縮或溶解，其中HUVEC-GEM組腫瘤細(xì)胞壞死情況最明顯，可見較大面積細(xì)胞壞死(壞死區(qū)域如箭頭所示)，這說明GEM增強(qiáng)了HUVEC疫苗誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞壞死。

2.3 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的抗體水平采用ELISA檢測(cè)各組治療方案誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 3所示，HUVEC及HUVEC-GEM組小鼠免疫血清中抗體水平有一定程度的上升，而GEM組未有HUVEC抗體產(chǎn)生。與HUVEC組比較，HUVEC-GEM組抗體水平也有上升(P<0.01)，這說明低劑量的GEM引入HUVEC疫苗后，不會(huì)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，反而在一定程度上會(huì)提升HUVEC疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平。

Fig 1 Therapeutic antitumor effect induced by GEM and HUVEC vaccine in subcutaneous pancreatic cancer-bearing mice n=3)

Fig 2 Histopathology study of tumor tissues (200×)

Fig 3 Detection of anti-HUVEC humoral immune responses

2.4 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性采用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組治療方案誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度，如Fig 4所示，PBS對(duì)照組與GEM組淋巴細(xì)胞未顯示明顯的增殖活性，而HUVEC和HUVEC-GEM組淋巴細(xì)胞均顯示了一定的增殖活性，其中HUVEC-GEM給藥組淋巴細(xì)胞增殖活性最明顯，與HUVEC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這說明低劑量GEM可以增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性。

2.5 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷活性我們進(jìn)一步使用美國Promega公司CytoTox96細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組治療方案誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷活性。如Fig 5所示，隨著E ∶T比值的增大，HUVEC及HUVEC-GEM組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性逐漸增高，其中HUVEC-GEM組殺傷活性最高(P<0.05vsHUVEC)。HUVEC-GEM組小鼠脾細(xì)胞在E ∶T為50 ∶1、100 ∶1及200 ∶1時(shí)均高于HUVEC組，而PBS和GEM組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞無殺傷功能。當(dāng)靶細(xì)胞為Pan02細(xì)胞時(shí)，所有組淋巴細(xì)胞未顯示殺傷活性，這說明疫苗誘導(dǎo)的CTL殺傷活性是HUVEC特異的。

Fig 4 Effect of different treatment on lymphocyte proliferation n=4)

Fig 5 Level of CTLs induced by different treatment n=4)

2.6 GEM增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的免疫血清IFN-γ含量采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠免疫血清中IFN-γ含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 6所示，HUVEC組[(158.33±9.51)ng·L-1]和HUVEC-GEM組[(225.32±11.99)ng·L-1]IFN-γ含量都有所升高，GEM單藥組免疫血清中未檢測(cè)到IFN-γ；此外，HUVEC-GEM治療后小鼠免疫血清中IFN-γ含量也遠(yuǎn)高于HUVEC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，以上結(jié)果均表明低劑量GEM可以增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度。

Fig 6 Detection of INF-γ content of immune sera n=3)

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展及對(duì)腫瘤微環(huán)境的不斷認(rèn)識(shí)，腫瘤免疫治療得到了更深入系統(tǒng)的研究。本論文所研究的HUVEC疫苗是一種靶向腫瘤新生血管的主動(dòng)免疫治療策略，可以依靠有限次數(shù)的治療誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)，抑制腫瘤血管的生成，拮抗腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，能夠克服單克隆抗體等傳統(tǒng)血管生成抑制劑類藥物用藥頻繁，毒副作用大，患者用藥負(fù)擔(dān)重的缺點(diǎn)[11]。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)HUVEC疫苗在預(yù)防性免疫中抗腫瘤作用明顯，但該疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤藥效并不能完全令人滿意，故而提升HUVEC疫苗的治療性抗腫瘤藥效是疫苗研發(fā)中的重要問題。

腫瘤抗原特異性CTL細(xì)胞是起主要?dú)饔玫男?yīng)細(xì)胞，如何誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)是腫瘤疫苗研發(fā)中的關(guān)鍵技術(shù)。自上世紀(jì)80年代研究人員發(fā)現(xiàn)低劑量環(huán)磷酰胺不僅不會(huì)產(chǎn)生免疫制劑作用，反而可以增加抗腫瘤免疫反應(yīng)以來，化療藥的免疫激活作用引起了研究人員的興趣。大量研究已證實(shí)持續(xù)節(jié)拍性非治療劑量化療藥能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可以協(xié)助腫瘤疫苗誘導(dǎo)更有效的CTL免疫應(yīng)答，提升疫苗的抗腫瘤藥效[12-14]。本論文中所考察的化療藥物GEM是胰腺癌一線化療藥物，臨床上已應(yīng)用多年，安全性有保障。本研究中，我們將其引入HUVEC疫苗，考察非治療劑量的GEM能否提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤作用，并以此為例探討非治療劑量化療藥增強(qiáng)HUVEC疫苗抗腫瘤作用的可能機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量GEM引入HUVEC疫苗免疫方案后，可以有效提升HUVEC疫苗的治療性抗胰腺癌作用，HUVEC-GEM組在治療性免疫中的抑瘤率可以達(dá)到56.44%；GEM的引入可以協(xié)助HUVEC疫苗有效改善荷瘤小鼠的腫瘤微環(huán)境，腫瘤組織HE染色結(jié)果證實(shí)HUVEC-GEM組出現(xiàn)了更多的腫瘤細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤；GEM引入后，協(xié)助HUVEC疫苗更有效的激活了B淋巴細(xì)胞，在經(jīng)過2、8及14 d 3次免疫后，HUVEC-GEM組小鼠免疫血清中產(chǎn)生了高水平的HUVEC-抗體；HUVEC-GEM組小鼠的T細(xì)胞應(yīng)答水平也明顯高于其它各治療組，說明GEM也增強(qiáng)了HUVEC疫苗激活腫瘤抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力，提升了HUVEC疫苗的特異性CTL殺傷活性；給藥過程中觀察各組小鼠證實(shí)HUVEC-GEM治療方案的毒副作用較單一給藥組并沒有明顯增加，實(shí)驗(yàn)小鼠的耐受性良好。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)低劑量GEM作為免疫佐劑能增強(qiáng)HUVEC疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，提升HUVEC疫苗在治療性免疫中的抗腫瘤藥效，本研究為HUVEC疫苗臨床治療方案提供了新選擇，有潛在巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。