蘆可替尼和地西他濱協(xié)同抑制TET2敲降的HEL細胞生長作用

付莉霞，王穎韶，肖方楠，宋濬哲，白姣姣，周 圓，白 潔

[1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津 300211；2.中國醫(yī)學科院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學科學院血液學研究所)，實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，天津 300020]

經(jīng)典的費城染色體陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)是一組造血干細胞惡性克隆性疾病，主要包括真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)。MPN可進展為骨髓纖維化(myelofibrosis，MF)，甚至轉化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)[1]。2005年，多個課題組發(fā)現(xiàn)MPN的造血細胞中存在JAK2V617F突變，在其發(fā)病機制和靶向治療研究中有重要意義[2-3]。該突變導致JAK-STAT級聯(lián)信號通路過度激活，從而引起紅細胞、血小板或粒細胞的過度增殖[4]。

TET2屬于α-草酸戊二酸依賴酶的家族，催化5-甲基胞嘧啶(5-mc)轉化為5-羥甲基-胞嘧啶(5-hmc)，通過改變基因的甲基化狀態(tài)并在表觀遺傳水平調(diào)控基因轉錄，該突變是MPN發(fā)展過程最常見的突變之一[5]。Moran-Crusio等[6-7]通過小鼠模型研究證實了JAK2V617F伴TET2缺失可以促進髓系細胞增生，從而加速MPN的進程。此外，Iurlo等[8-9]通過分析MPN病人的基因突變與其預后的相關性發(fā)現(xiàn)TET2突變的存在會增加PV患者向AML轉化的風險。

進展為AML的MPN患者生存極差，且常規(guī)的化療藥物緩解率低，患者耐受性差。DNA甲基轉移酶抑制劑地西他濱和阿扎胞苷是加速/急性期MPN(accelerated or blast phase disease MPN，MPN-AP/BP)的主要治療藥物。其中，地西他濱除誘導G2/M期的細胞阻滯外，還可通過抑制DNA甲基轉移酶來影響DNA的轉錄來殺傷腫瘤細胞。研究報道，伴有TET2突變的MDS/AML去甲基化治療有效率較高。但地西他濱對TET2和JAK2V617F共突變腫瘤細胞的有效性，及蘆可替尼是否協(xié)同地西他濱殺傷TET2和JAK2V617F共突變腫瘤細胞尚未明確。本文在攜帶JAK2V617F的HEL細胞中建立了TET2敲降模型，對地西他濱和蘆可替尼的敏感性及其協(xié)同作用進行評價，為TET2和JAK2V617F共突變的MPN患者提供臨床治療的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑及儀器地西他濱購自MCE(批號17685)；蘆可替尼為諾華公司惠贈；細胞培養(yǎng)基DMEM(批號8119392)、RPMI 1640(批號8120354)和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(批號04-001-1)均購自BI；CCK-8試劑盒(批號04-001-1)購自日本Dojindo Laboratories; TRIzol(批號279511)購自Invitrogen; ImpromⅡ反轉試劑盒(批號0000134688)購自Promega; Real-time DNA聚合酶mixture(批號)(FastStart Univeral SYBR Green Master)購自Roche(批號46660900)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根(批號U8915)；流式細胞儀Canto II購自美國Becton Dickinson公司；熒光倒置顯微鏡TE2000-S購自日本Nikon 司；高速離心機(型號Avavti J-26 XP)購自美國Beckman Coulter公司；ImageQuant LAS 4000發(fā)光成像儀購自GE。

1.2 細胞株及培養(yǎng)條件293T細胞株，HEL細胞株均購自ATCC細胞庫，由中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學科學院血液學研究所)細胞庫保管。293T細胞培養(yǎng)于DMEM+10%FBS培養(yǎng)基中，HEL細胞懸浮培養(yǎng)于RPMI 1640+10% FBS中，細胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d離心換液，293T細胞在 70%-90%融合后經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3 慢病毒包裝及病毒滴度測定TET2和PIGPZ shRNA購自Dharmacon(GE Healthcare Dharmaco，美國)。shRNA的靶向序列是TATGAGTCTCGAAC TCGCT，靶向人TET2基因編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)2383-2401位點，位于外顯子3(NCBI序列號：NM_001127208.3)。包裝載體psPAX2、pCMV-VSV-G由英國帝國理工學院Ernesto Yague博士惠贈。載體骨架結構為Fig 1A，通過已建立的方法進行病毒包裝和滴度測定[10]。

1.4 慢病毒感染HEL細胞取對數(shù)生長的HEL細胞加入24孔細胞培養(yǎng)板中(1×105/孔)。根據(jù)MOI值5-10計算加入病毒體積(感染細胞數(shù)×被感染細胞MOI值/濃縮后慢病毒滴度)，最后用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液定容至500 μL/孔。1 800 r·min-1，33 ℃，離心90 min，6 h后換液。d 2用相同方法做二次感染。感染48 h后，流式細胞儀分選GFP+細胞用作后續(xù)實驗。

1.5 RNA提取及Real-time PCR取對數(shù)生長期的EV HEL和TET2-KD HEL細胞2×106，TRIzol法提取RNA后進行反轉錄，然后進行Real-time PCR，引物設計參照文獻[11]，反應體系為(10 μL)：SYBR Green Master 5 μL，上下游引物各0.5 μL，Template cDNA 0.5 μL，ddH2O(RNase-free)4 μL。反應條件為：95 ℃ 10 min 1個循環(huán)，95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s共40-45個循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.6 細胞增殖檢測取對數(shù)生長期的EV HEL和TET2-KD HEL細胞，用含有10% FBS的RPMI 1640調(diào)整濃度為8×107·L-1，接種于96孔板中，每孔90 μL，EV-HEL和TET2-KD HEL細胞各3個復孔。培養(yǎng)后每孔加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育4 h，輕輕震蕩混勻。酶標儀檢測450 nm光密度(OD)值，檢測d 0、1、2、3、4、5和6細胞增殖情況。

1.7 72 h藥物半數(shù)致死劑量(IC50)測定采用CCK-8測定細胞對蘆可替尼和地西他濱等化療藥物的敏感性。取對數(shù)生長期的EV-HEL和TET2-KD HEL細胞，用含有10%FBS的RPMI 1640調(diào)整濃度為8×107·L-1，接種于96孔板中，每孔90 μL，分組加藥，每個濃度設3個平行孔，處理組加不同濃度的藥物，陰性對照組加等體積的藥物溶劑，培養(yǎng)72 h后每孔加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育4 h，輕輕震蕩混勻。酶標儀檢測450 nm光密度(OD)值。按以下公式計算藥物對細胞的生長抑制率。抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值[12]。

1.8 藥物協(xié)同指數(shù)測定參考單藥時的IC50值，蘆可替尼選擇0.5、1和2 μmol·L-1。地西他濱選擇3.2、16 和80 nmol·L-1，進行單藥抑制作用測定和各個濃度兩兩混合的抑制作用測定。參照測定藥物IC50時的細胞濃度和鋪板方式進行試驗，每種濃度組合3個平行孔，設計3×3矩陣。加藥處理72 h后，通過CCK-8檢測細胞活性。分別計算每個濃度組合下對細胞的抑制率，CalcuSyn軟件計算各個濃度組合下的藥物CI值。CI值<1.0代表兩種藥物在該濃度組合下具有協(xié)同效應，CI值>1.0代表兩種藥物在該濃度組合下具有拮抗效應[13]。

1.9 細胞系克隆形成(colony formation cells, CFC)實驗取對數(shù)生長期的EV-HEL和TET2-KD HEL細胞，用含有10%FBS的1640調(diào)整濃度為8×107·L-1后接種于24孔板中，每孔1 mL，根據(jù)72 h的IC50值分別用2 μmol·L-1的蘆可替尼和30 nmol·L-1地西他濱分別處理EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#24 h后，再次計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為2×107·L-1，分別取30 μL加入到1.2 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基H4230，補充300 μL RPMI 1640培養(yǎng)基使各處理組體積相同，渦旋混勻，4 ℃冰箱靜置10 min至氣泡升至液面上部。用1 mL注射器(20 mL的槍尖)將混勻的細胞加入24孔板中，每孔0.4 mL(約200個細胞)，每個處理組3個重復孔。于37 ℃，5% CO2，濕度>95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用無菌的PBS填充其余的孔以防半固體培養(yǎng)基干燥，14 d后計數(shù)不同的大小集落形成單位。

2 結果

2.1 建立TET2敲降的HEL細胞系HEL細胞是攜帶JAK2V617F人紅白細胞白血病細胞系，常用作MPN研究。為了探究蘆可替尼和地西他濱對JAK2V617F和TET2雙突變細胞的影響，我們在體外利用shRNA在HEL細胞中敲降TET2(TET2-KD HEL)。首先，我們將TET2 shRNA和空載質(zhì)粒進行了慢病毒包裝，并分別感染HEL細胞。EV HEL作為對照組，TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#作為實驗組。接著我們通過流式細胞術評價感染效率，EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#感染效率分別為97.8%、88.4%和88%(Fig 1B)。因此我們進行了流式分選并在分選后再次通過流式細胞術進行陽性率評估，EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#陽性率分別為99.6%、100%和99.9%(Fig 1C)。接下來，我們利用Real-time PCR對TET2敲降效率進行了評估，發(fā)現(xiàn)敲降組TET2的表達下降了35%-40%(Fig 1D)。提示成功建立EV HEL和TET2-KD HEL細胞系。

2.2TET2敲降后HEL細胞增殖能力增加有小鼠模型研究表明，在JAK2V617F和TET2敲降的雙突變小鼠中髓系細胞細胞增殖能力增加[14]。為了研究TET2敲除對HEL細胞生物學功能的影響，我們通過CCK-8方法檢測EV HEL和TET2-KD HEL細胞的增殖情況，通過檢測d 0到d 6細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與EV HEL相比，TET2-KD HEL增殖能力明顯增加(Fig 2，P<0.05)。

Fig 1 The positive rate and knockdown efficiency of HEL cells after lentivirus transfection

Fig 2 Proliferation of EV HEL, TET2-KD HEL1# and TET2-KD HEL2#

2.3TET2敲降后HEL細胞藥物敏感性測定為了探索蘆可替尼和地西他濱對TET2-KD HEL的抑制作用，我們通過藥物處理72 h后的 IC50評價其對蘆可替尼和地西他濱的敏感性。研究結果發(fā)現(xiàn)：蘆可替尼在EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#中IC50(72 h)差異無顯著性，分別為(1.653±0.27)、(1.979±0.398)和(1.814±0.328 1)μmol·L-1(Fig 3A和3C，n=3)。但是，相較于EV-HEL而言，TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#對地西他濱的敏感性下降，其IC50(72 h)分別為(0.03±0.005)、(0.067±0.014)和(0.058±0.008)μmol·L-1，差異具有統(tǒng)計學意義(Fig 3B和3C，n=3，P<0.05)。接下來，我們分別用2 μmol·L-1蘆可替尼和30 nmol·L-1地西他濱處理EV-HEL、TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#，并進行半固體克隆形成實驗，結果顯示TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#在蘆可替尼和地西他濱單藥處理后耐藥克隆數(shù)均高于EV-HEL，且其中大克隆的數(shù)目明顯增加(Fig 3D，n=3，P<0.05)。以上結果提示，雖然72 h藥物敏感試驗中TET2-KD HEL仍然對蘆可替尼敏感，但是卻對地西他濱存在耐藥現(xiàn)象，且隨著時間的增加，TET2-KD HEL對蘆可替尼和地西他濱的藥物敏感性均顯著下降。

Fig 3 IC50 and drug-resistant colony numbers of ruxolitinib and dectabine on EV-HEL, TET2-KD HEL1# and TET2-KD HEL2# cells

Fig 4 Combination index of ruxolitinib and decitabine

2.4 蘆可替尼和地西他濱在TET2敲降HEL細胞中有協(xié)同抑制作用臨床研究證實，在MPN-AP/BP患者聯(lián)合蘆可替尼和地西他濱，MPN-AP/BP耐受性較好[15]。考慮到TET2-KD HEL對地西他濱耐藥，因此，我們在EV HEL和TET2-KD HEL中聯(lián)合應用蘆可替尼和地西他濱，觀察其是否有協(xié)同作用。結果顯示，與單獨用藥相比，這兩種藥物的組合對于EV-HEL細胞的生長無明顯抑制作用，但在TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#細胞中，通過計算其抑制率并通過CalcuSyn軟件分析其協(xié)同指數(shù)CI值，發(fā)現(xiàn)其在多個濃度組合下有明顯協(xié)同效應，且蘆可替尼1 μmol·L-1和地西他濱80 nmol·L-1聯(lián)合用藥對TET2-KD HEL1#和TET2-KD HEL2#抑制率分別可達到80%和82%。以上研究結果提示，對于TET2和JAK2V617F雙突變的MPN患者而言，蘆可替尼聯(lián)合地西他濱可能是一種行之有效的用藥方案。

3 討論

JAK2V617F突變是MPN患者最常見的驅動型突變之一，該突變的發(fā)現(xiàn)在MPN患者機制研究和靶向治療過程有里程碑意義，研究發(fā)現(xiàn)90%以上的PV患者有JAK2V617F突變，在ET和PMF患者中其突變頻率也可達50%以上，該突變導致JAK激酶對細胞因子高度敏感或不依賴細胞因子仍能持續(xù)活化，從而激活下游的STAT3/5或PI3K/AKT等通路，促進造血細胞的過度增殖，并導致MPN的發(fā)生。研究表明，PV、ET和PMF10年內(nèi)進展為AML的比率分別為2.3%-14.4%、0.7%-3%和10%-20%[16]。JAK1/2抑制劑蘆可替尼可以明顯改善MPN患者的體質(zhì)性癥狀，縮小脾臟體積，并延緩脾大的發(fā)生，但蘆可替尼單藥治療MPN-AP/BP患者還沒有相關報導。

隨著二代測序技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)MPN患者中除了常見的JAK2V617F、CALR和MPL突變外，許多其它與表型和預后密切相關的基因突變也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中包括TET2、ASXL1和DNMT3A等表觀遺傳學突變，TET2是其最常見的伴隨突變之一。小鼠實驗證實，TET2缺失的JAK2V617F突變小鼠表現(xiàn)為白細胞的增多、脾腫大、髓外造血及生存期縮短，且疾病進展迅速。而通過分析MPN病人的分子學突變與疾病發(fā)生和轉歸相關性，也發(fā)現(xiàn)TET2突變不僅參與MPN疾病的發(fā)生，還與疾病的進展及不良預后密切相關。因此，針對多種信號通路的聯(lián)合用藥可能會為改善MPN-AP/BP患者治療現(xiàn)狀、提高治療效果提供可行的方案。

考慮到表觀遺傳學突變在MPN的發(fā)生與疾病進展中其重要作用，因此目前在MPN-AP/BP患者中使用蘆可替尼聯(lián)合表觀遺傳學相關的小分子藥物也是臨床研究的熱點之一。DNA的去甲基化藥物阿扎胞苷和地西他濱都可以調(diào)節(jié)DNA的去甲基化而影響其轉錄活性，但其對JAK2V617F和TET2雙突變MPN患者具體作用尚未明確。

本研究通過建立TET2-KD HEL細胞系，發(fā)現(xiàn)相較于EV HEL，TET2-KD HEL細胞增殖能力增加，且TET2-KD HEL對地西他濱存在耐藥現(xiàn)象。為了探索新的聯(lián)合用藥方案，我們將蘆可替尼和地西他濱聯(lián)合應用于EV HEL和TET2-KD HEL，發(fā)現(xiàn)該組合在TET2-KD HEL中有協(xié)同作用。有研究報道JAK2可以在酪氨酸1939和1946位點使TET2磷酸化，而磷酸化的TET2與類紅細胞轉錄因子KLF1相互作用導致紅系祖細胞的激活而促進MPN疾病的發(fā)生和進展。在MPN患者樣本和小鼠模型中發(fā)現(xiàn)激活的JAK2V617F突變與TET活性和胞嘧啶羥甲基化的變化有關。這些表觀遺傳和功能變化也與一些致癌基因轉錄表達增加有關。且在MPN患者樣本中發(fā)現(xiàn)JAK2V617F單突變的患者全基因組胞嘧啶甲基化顯著降低，而在JAK2V617F和TET2并沒發(fā)生該現(xiàn)象[17]。以上結果提示JAK2V617F和TET2雙突變患者的甲基化異常狀態(tài)可能是其對地西他濱耐藥的主要原因。

總之，該研究證實TET2敲降后JAK2V617F陽性的HEL 細胞系對地西他濱耐藥，蘆可替尼和地西他濱在TET2-KD HEL有協(xié)同抑制作用。提示在TET2和JAK2V617F雙突變MPN患者中聯(lián)合應用蘆可替尼和地西他濱可能是一種有效可行的治療方案。