謝偉明,陳志武,郭 巖
(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,安徽 合肥 230032)
硫巰基化(S-sulfhydration)是繼乙?;?acetylation)和磷酸化(phosphorylation)等之后發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式[1],硫巰基化修飾可以被二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)等還原劑抑制[2]。
硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是機體內(nèi)一種重要的氣體信號分子[3],與多種生理及病理過程有關(guān)。H2S具有抗神經(jīng)細胞凋亡、抗炎癥反應(yīng)、保護血腦屏障等效應(yīng)[4]。有研究表明,H2S可通過硫巰基化修飾靶蛋白的半胱氨酸殘基,使半胱氨酸的-SH基團轉(zhuǎn)化為-SSH或過硫酸鹽基團,改變靶蛋白的生物學(xué)功能,如H2S硫巰基化修飾ATP敏感性鉀離子(KATP)通道蛋白的半胱氨酸殘基,進而影響該通道開放[5]。
RhoA-Rho激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機體內(nèi)一種與細胞的生長、增殖和分化等功能有關(guān)的信號通路,與高血壓和缺血性腦損傷等血管性疾病密切相關(guān)。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,有ROCK1和ROCK2兩種亞型,ROCK2主要表達在大腦、心臟和肌肉中[6]。有研究表明ROCK2激活促進缺血性神經(jīng)元損傷,而抑制ROCK2活性或者降低ROCK2蛋白表達,可減輕神經(jīng)元損傷[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)H2S對小鼠腦缺血損傷具有明顯保護作用,并可抑制小鼠腦血管平滑肌細胞中ROCK2活性[8]。但是,H2S抑制ROCK2活性的機制至今未見明確報道。鑒于ROCK2分子結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸富集的鋅指樣結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich zine finger-like motifdomain,CRD)中富含半胱氨酸殘基[9],H2S是否通過硫巰基化修飾來抑制神經(jīng)細胞中ROCK2活性抗神經(jīng)細胞H/R損傷?因此,本研究擬探討H2S是否可通過抑制ROCK2對大鼠神經(jīng)細胞H/R損傷產(chǎn)生保護作用及其ROCK2抑制作用的硫巰基化修飾機制。
1.1 藥品與試劑ROCK2抗體,購自Abcam公司,批號:125025;NaHS,購自Sigma公司,批號:#SHBF1746V;鏈霉親和素瓊脂糖珠,購自北京博爾西科技有限公司,批號:B190319;ROCK2活性試劑盒,購自江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號:0069R1;Biotin-HPDP,購自APExBIO公司,批號:A800831337769;細胞凋亡試劑盒,購自北京四正柏生物有限公司,批號:20200820;二硫蘇糖醇(DTT),購自阿拉丁試劑有限公司,批號:D8220。
1.2 儀器流式細胞儀(美國BD公司);凝膠電泳儀和電泳槽(美國BIO-RAD公司);TGL-16H超速冷凍離心機(珠海黑馬儀器有限公司);細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)
1.3 動物SPF級SD大鼠新生鼠,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,實驗動物合格證號:SCXK(皖)2017-001。
1.4 方法
1.4.1原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細胞[10]取新生24 h內(nèi)的SD大鼠,在麻醉狀態(tài)下斷頭取腦并剝離海馬組織,0.125%胰酶液消化20 min,加入10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,巴氏吸管將組織吹散,70 μm細胞過濾器過濾,1 000 r·min-1常溫離心5 min并留沉淀。加入完全培養(yǎng)基重懸細胞,調(diào)整細胞數(shù)目為1×107個·L-1,接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被好的6孔板中,24 h后用專用培養(yǎng)基(Neurobasal+2% B27+0.5 mmol·L-1L-glutamine+1%青霉素-鏈霉素溶液)半量換液,每隔3 d全量換液。
取培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細胞,用4%的多聚甲醛室溫固定10 min,PBS溶液清洗后,加0.3% Tritonx-100放置30 min。棄掉Tritonx-100,清洗3遍,滴加10%山羊血清工作液封閉30 min。加1 ∶100稀釋的一抗MAP2,4 ℃放置過夜,次日清洗后滴加同樣稀釋倍數(shù)的FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗,室溫避光放置1 h,于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,進行海馬神經(jīng)元細胞的鑒定。
1.4.2硫巰基化蛋白的分離純化 采用改良生物素轉(zhuǎn)換法[1]分離純化硫巰基化蛋白。在培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細胞中分別加入50、100、200 μmol·L-1NaHS或等體積的生理鹽水(NS)培養(yǎng)24 h后,調(diào)節(jié)細胞懸液為每mL含有1×105個神經(jīng)元,取500 μL細胞懸液置于6孔培養(yǎng)板中,加入100 μL的蛋白裂解液,置冰盒上裂解30 min,離心取上清并進行蛋白定量。將200 μL上清液加入2 mL離心管中,再加入800 μL甲基硫代磺酸甲酯(Methyl methanethiosulfonate,MMTS)和HENS緩沖液配制的終止緩沖液,50 ℃恒溫水浴30 min,封閉剩余的游離巰基。加入1 mL-20 ℃預(yù)冷的丙酮靜置30 min后15 000 r·min-14 ℃離心20 min。加入1 mL HENS緩沖液將留下的沉淀吹打溶解。再加入250 μL Biotin-HPDP工作液混勻,室溫避光放置過夜。次日再加滿-20 ℃預(yù)冷的丙酮,-20 ℃冰箱中靜置30 min,立即12 000 r·min-14 ℃離心20 min,棄上清。加入1 mL HENS緩沖液吹打溶解,加入50 μL鏈霉親和素瓊脂糖珠,室溫避光放置24 h。再12 000 r·min-1離心2 min后棄上清,用HENS緩沖液重懸瓊脂糖珠并反復(fù)離心洗滌3次,用洗脫緩沖液洗脫瓊脂糖珠后得到純化的硫巰基化蛋白。
1.4.3ROCK2或硫巰基化ROCK2(SSH-ROCK2)的蛋白含量檢測 神經(jīng)元總蛋白或硫巰基化蛋白中的ROCK2含量分別用Western blot法測定。將100 μg的總蛋白或硫巰基化蛋白置100 ℃變性后,在12% SDS聚丙稀酰胺凝膠中電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶中封閉1.5 h,ROCK2一抗孵育過夜。次日加入HRP標記的二抗孵育1 h。TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯影并拍照以兔抗β-actin多克隆抗體為內(nèi)參照,Image J進行灰度值分析。
1.4.4ROCK2活性檢測 將培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元細胞隨機分為NS對照組和NaHS(200 μmol·L-1)組。NaHS或生理鹽水處理24 h后,將NaHS組進行硫巰基化蛋白分離純化。采用Western blot法定量分析各組ROCK2蛋白的濃度,以灰度值的比值來調(diào)整ROCK2蛋白的濃度,待濃度一致后再進行ROCK2活性檢測。將蛋白樣品加入到96孔板中,并設(shè)置空白孔和標準孔,按試劑盒說明書進行操作,以空白孔調(diào)零,450 nm波長測吸光度。
1.4.5神經(jīng)細胞缺氧復(fù)氧損傷模型的建立 將原代海馬神經(jīng)細胞隨機分為正常對照組、模型組、NaHS(50、100、200 μmol·L-1)組、硫巰基化抑制劑DTT組以及NaHS(200 μmol·L-1)+DTT組。除正常對照組外,細胞預(yù)處理24 h后棄去培養(yǎng)基加入缺氧液,置于90% N2-10% CO2三氣培養(yǎng)箱中孵育4 h,再更換成完全培養(yǎng)基置于正常三氣培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)孵育12 h,進行后續(xù)實驗。
1.4.6CCK-8法檢測細胞活力 取缺氧4 h/復(fù)氧12 h鋪滿96孔板(100 μL/孔)的神經(jīng)元,每孔加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度,計算細胞活力。
1.4.7檢測培養(yǎng)上清中LDH、NSE水平 使用試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH和NSE活性。
1.4.8細胞凋亡檢測 將細胞用不含EDTA的胰酶消化吹打分離出后,加入1 ∶3稀釋的結(jié)合緩沖液。將5 μL Annexin V和10 μL碘化丙啶(PI)加入100 μL細胞懸液中避光放置5 min,立即檢測各組凋亡率。
2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定取生長8 d的大鼠海馬細胞,用神經(jīng)元特異性標志物MAP2免疫熒光法進行細胞鑒定。如Fig 1所示,原代培養(yǎng)的細胞的細胞核被DAPI染成藍色,和陰性對照組相比,胞體和軸突經(jīng)MAP2抗體染色呈綠色熒光,結(jié)果表明所培養(yǎng)的大鼠海馬細胞為神經(jīng)元。
2.2 NaHS對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的影響
2.2.1NaHS對細胞活力及LDH和NSE活性的影響 如Fig 2A所示,與正常對照組相比,H/R模型組細胞活力顯著降低(P<0.01),而給予外源性H2S供體NaHS 100和200 μmol·L-1可顯著提高H/R損傷導(dǎo)致的細胞活力降低(P<0.01,與模型組相比);Fig 2B和Fig 2C顯示,相比正常對照組,H/R模型組細胞上清中LDH和NSE活性有明顯提高,提示H/R損傷細胞致NSE和LDH漏出增多。相比模型組,100和200 μmol·L-1NaHS可降低H/R導(dǎo)致的神經(jīng)細胞LDH和NSE的漏出(P<0.01),50 μmol·L-1NaHS也可明顯降低神經(jīng)細胞H/R后培養(yǎng)上清中NSE活性。結(jié)果表明H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護作用。Fig 2A、Fig 2B和Fig 2C還顯示,聯(lián)合應(yīng)用硫巰基化修飾阻斷藥DTT顯著阻斷200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的細胞活力降低和上清液中LDH和NSE活性增高的抑制作用(與200 μmol·L-1NaHS組相比,P<0.01),對DTT單獨應(yīng)用對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力降低和細胞上清液中LDH和NSE活性增高無明顯的影響。以上結(jié)果表明,外源性H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的保護機制可能與蛋白質(zhì)的硫巰基化修飾有關(guān)。
2.2.2NaHS對細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢查結(jié)果(Fig 3A)顯示:H/R模型組細胞凋亡率明顯高于正常對照組(P<0.01),而50、100、200 μmol·L-1NaHS均可降低H/R對細胞凋亡率的影響(與模型組組相比,P<0.05)。結(jié)果表明H2S可抑制H/R損傷導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡。與細胞活力及培養(yǎng)上清中LDH和NSE活性的改變相似,聯(lián)合應(yīng)用DTT可降低200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用(與200 μmol·L-1NaHS組相比,P<0.01),而DTT單獨應(yīng)用同樣對H/R損傷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡無明顯的影響。結(jié)果表明外源性H2S抗大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的機制與硫巰基化修飾有關(guān)。
Fig 1 Identification of rat neurons by MAP2 under fluorescence microscope (×100)
Fig 2 Protection of NaHS on H/R injury in rat neurons and effect of S-sulfhydration on protection n=6)
2.3 NaHS對大鼠海馬神經(jīng)元ROCK2蛋白表達和活性的影響原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞,并給予不同濃度NaHS(50、100、200 μmol·L-1)。Western blot結(jié)果(Fig 4A)表明,與NS對照組相比,100和200 μmol·L-1NaHS可以降低大鼠海馬神經(jīng)細胞中ROCK2蛋白的表達(P<0.01);Fig 4B顯示200 umol·L-1NaHS可以降低海馬神經(jīng)細胞中ROCK2活性(與NS對照組相比,P<0.01)。結(jié)果表明H2S對大鼠海馬神經(jīng)細胞中ROCK2蛋白表達和活性均有明顯抑制作用。
Fig 4 Effects of NaHS on ROCK2 protein expression and activity in rat neurons n=3)
2.4 NaHS促進大鼠海馬神經(jīng)元中ROCK2的硫巰基化原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞,并給予不同濃度NaHS(50、100、200 μmol·L-1),24 h后,經(jīng)過生物素化處理得到各組硫巰基化修飾蛋白,以硫巰基化修飾ROCK2蛋白量和總ROCK2蛋白量二者比值來定量分析NaHS對硫巰基化修飾ROCK2蛋白的影響,結(jié)果如Fig 5所示,與NS對照組相比,NaHS 100和200 μmol·L-1孵育24 h可提高原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中硫巰基化ROCK2(SSH-ROCK2)蛋白的含量(P<0.01),表明H2S可促進海馬神經(jīng)元中ROCK2蛋白的巰基化修飾。
Fig 5 Effect of NaHS on protein level of S-sulfhydration ROCK2(SSH-ROCK2)in rat neurons n=3)
2.5 硫巰基化對ROCK2活性的影響為觀察硫巰基化對ROCK2活性的影響,本研究從分別對照組和NaHS處理組海馬神經(jīng)元中提取總蛋白,分離純化NaHS處理組細胞的硫巰基化蛋白,運用Western blot調(diào)整對照組總蛋白中的ROCK2蛋白含量與NaHS處理組硫巰基化蛋白中的SSH-ROCK2蛋白含量相等,繼而測定ROCK2活性。結(jié)果如Fig 6所示,200 μmol·L-1NaHS處理組細胞中的SSH-ROCK2活性明顯低于對照組細胞中的ROCK2活性,提示ROCK2硫巰基化修飾可明顯降低其活性。
Fig 6 Effect of S-sulfhydration on ROCK2 activity in rat neurons n=3)
腦缺血/再灌注損傷是目前臨床上高致殘率、高致死率的主要疾病之一[11]。腦缺血/再灌注損傷以及細胞的H/R損傷均可導(dǎo)致細胞膜破損,造成神經(jīng)細胞內(nèi)的一些重要酶,比如LDH和NSE的外漏[12]。本研究在大鼠海馬神經(jīng)元H/R模型上,發(fā)現(xiàn)外源性H2S供體NaHS明顯抑制H/R損傷誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)清液中LDH和NSE活性增高,表明H2S可抑制H/R損傷導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元中LDH和NSE的外漏。同時,NaHS還可抑制H/R損傷誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的活力降低和細胞凋亡,進一步明確H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護作用。
Chang等[13]發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK2信號通路參與了腦缺血/再灌注損傷,而抑制ROCK2蛋白的表達可抑制腦缺血/再灌注后的神經(jīng)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)NaHS 100和200 μmol·L-1對大鼠海馬神經(jīng)元中ROCK2蛋白表達和活性有明顯的抑制作用,這與我們以前報道的H2S可抑制小鼠平滑肌細胞中ROCK2活性[9]是一致的。因此,我們的結(jié)果提示H2S對海馬神經(jīng)元H/R損傷保護作用可能與抑制ROCK2蛋白表達和活性有關(guān)。但是H2S抑制ROCK2活性的機制需要進一步闡明。
近年來的研究表明,H2S可將某些靶蛋白半胱氨酸殘基的SH基團轉(zhuǎn)化為-SSH或過硫酸鹽基團,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,這被稱為硫巰基化(S-sulfhydration)修飾[5]。硫巰基化修飾是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,如H2S通過硫巰基化修飾血管平滑肌細胞的KATP通道,可引起通道的開放和鉀離子外流而導(dǎo)致血管舒張[14]。RhoA-ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一種重要的細胞內(nèi)信號通路,參與了多種細胞功能的調(diào)節(jié)。ROCK是RhoA最直接的效應(yīng)分子,在腦細胞中,以ROCK2表達為主。鑒于ROCK2分子結(jié)構(gòu)中含有較多的半胱氨酸殘基[15],H2S有可能通過半胱氨酸殘基來硫巰基化修飾轉(zhuǎn)錄表達的ROCK2,并進而影響ROCK2活性。本研究通過改良生物素轉(zhuǎn)換法[1]分離純化硫巰基化蛋白,并結(jié)合Western blot法檢測了硫巰基化蛋白中的SSH-ROCK2,結(jié)果表明100、200 μmol·L-1NaHS可以增加大鼠海馬神經(jīng)元中的SSH-ROCK2蛋白水平,證實了H2S可硫巰基化修飾大鼠海馬神經(jīng)元中的ROCK2。靶蛋白翻譯后的修飾可影響其功能。本研究進一步發(fā)現(xiàn)NaHS組大鼠海馬神經(jīng)元中的SSH-ROCK2活性明顯低于對照組中的ROCK2活性,表明H2S硫巰基化大鼠海馬神經(jīng)元中的ROCK2,并抑制其活性,這可能是H2S保護大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷作用的重要機制之一。
硫巰基化修飾可被DTT等還原劑所逆轉(zhuǎn)[2]。本研究在在大鼠海馬神經(jīng)元H/R模型上,觀察到了DTT可明顯地阻斷200 μmol·L-1NaHS對H/R損傷誘導(dǎo)的細胞活力降低、細胞中LDH和NSE外漏及細胞凋亡的抑制作用,結(jié)果提示硫巰基化修飾參與了H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷的保護作用,這與H2S硫巰基化ROCK2并抑制其活性的結(jié)果是一致的,但也不能排除H2S對如KATP通道等其它蛋白質(zhì)的硫巰基化是否也參與了其保護作用,今后研究需要進一步明確。本研究首次闡明了H2S介導(dǎo)的硫巰基化修飾發(fā)生在RhoA-ROCK信號通路RhoA激酶2(ROCK2)中。也首次闡明了H2S介導(dǎo)的ROCK2硫巰基化修飾是H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷產(chǎn)生保護作用的機制之一,為腦缺血/再灌注損傷的臨床研究提供了一個新的方向。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)H2S對大鼠海馬神經(jīng)元H/R損傷有明顯的保護作用,其機制與硫巰基化修飾致ROCK2活性降低及ROCK2蛋白表達減少有關(guān)。