環(huán)孢素A對柔紅霉素損傷H9c2心肌細胞的保護作用

吳枝娟，陳世珍,3，徐麗霞，何瑞嵐，焦海霞,林默君

(福建醫(yī)科大學 1.心血管病離子通道信號調(diào)控福建省高校重點實驗室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系, 福建 福州 350108; 3.湖北省第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科, 湖北 武漢 430033)

以柔紅霉素(daunorubicin，DNR)、阿霉素為代表的蒽環(huán)類藥物(anthracyclines，ANT)具有廣譜抗腫瘤作用，是許多腫瘤化療方案的基礎(chǔ)性用藥。心臟毒性是蒽環(huán)類藥物化療中最常見和嚴重的不良反應(yīng)，目前尚無有效的臨床防治措施。蒽環(huán)類藥物心臟毒性(anthracycline induced cardiotoxicity，AIC)發(fā)病機制非常復雜，涉及心肌細胞活性氧累積、鈣穩(wěn)態(tài)破壞、炎癥免疫、心肌細胞凋亡等多種途徑[1-2]。新近發(fā)現(xiàn)，抑制或降低天然和獲得性免疫、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的藥物有助于減少腫瘤幸存者心臟相關(guān)死亡[2-3]。

環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)是移植排異反應(yīng)和免疫性疾病常用的強效免疫抑制劑，還作為化療增敏劑用于ANT耐藥的防治[4-5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，CsA對心肌缺血/再灌注損傷及心肌肥大具有一定的保護作用[6-8]。CsA對ANT心肌損傷的作用尚不明確，相關(guān)資料很少，且存在一定的爭議[9-12]。本研究以DNR處理H9c2細胞建立心肌損傷模型，觀察CsA對細胞生存率、心肌損傷、氧化應(yīng)激及細胞凋亡的影響，為綜合評估CsA在AIC中的作用提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 H9c2(2-1)大鼠心肌細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑 注射用鹽酸柔紅霉素購于山東新時代藥業(yè)公司，批號：037170301。環(huán)孢素注射液購于瑞士Novartis Pharma公司，批號：SY695。NFAT抑制劑(VIVIT多肽，HY-P1026)購于美國MCE公司。胎牛血清(10099141C)購于美國Life Technologies公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(#11995115)購于美國Invitrogen公司。MTS細胞增殖試劑盒(G5421)購于美國Promega公司。Bax(BM3964)、心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)(A01318)抗體均購于武漢博士德生物工程公司。Bcl-2抗體購于親科生物公司(AF6139)。β-actin(8H10D10)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。肌酸激酶(creatinekinase，CK)試劑盒(A032-1-1)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)(微板法)試劑盒(A020-2-2)均購于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、RIPA裂解液(P0013B)、Hoechst 33342染色液(C1025)、GreenNuc活細胞caspase-3活性檢測試劑盒(C1168S)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(S0033S)均購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3儀器 恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；酶標儀(美國BioTek 公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；蛋白電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD 公司)；生物分子成像儀(日本GE Healthcare公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理 H9c2大鼠心肌細胞以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。每2-3 d以0.25%胰酶消化傳代1次。不同濃度CsA處理對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的H9c2心肌細胞2 h，再加入1 μmol·L-1DNR 共培養(yǎng)24 h。DNR組以1 μmol·L-1DNR 處理24 h，Control組加入等體積培養(yǎng)液。

1.2.2MTS法測定細胞生存率 細胞接種96孔板，每孔加入10 μL MTS工作液。置37 ℃環(huán)境孵育4 h，檢測490 nm各孔光密度值(optical density，OD)。各實驗組設(shè)4個復孔，空白組加入無細胞培養(yǎng)液及MTS溶液。細胞生存率/%=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3CK及LDH活性檢測 收集細胞制備裂解液，BCA法確定蛋白濃度，同時收集各實驗組培養(yǎng)液上清。按說明書操作，測定各處理組細胞裂解液CK及培養(yǎng)液上清LDH活性。

1.2.4免疫細胞化學檢測 95%乙醇固定細胞，依次加入過氧化酶阻斷劑和封閉血清。4 ℃濕盒中一抗孵育過夜。二抗孵育30 min，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶工作液孵育10 min。DAB顯色，待出現(xiàn)明顯棕色、背景無明顯著色時中止顯色。脫水封片，光鏡下隨機選取6個視野，計算平均光密度(IOD·Area-1)。

1.2.5DCF-DA熒光檢測細胞內(nèi)ROS含量 10 μmol·L-1DCFH-DA染液37 ℃孵育20 min。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，激光共聚焦顯微鏡檢測綠色熒光。隨機選取10個視野，計算細胞平均熒光強度。

1.2.6Hoechst 33342染色 Hoechst 33342染色液避光孵育20 min。去除多余染液，PBS充分清洗。發(fā)射波長460 nm，激發(fā)波長350 nm，熒光顯微鏡觀察。凋亡細胞核呈致密濃染顆粒塊狀亮藍色熒光。鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)凋亡細胞百分率。

1.2.7caspase-3活性檢測 細胞處理完畢，更換含5 μmol·L-1GreenNuc caspase-3底物的新鮮培養(yǎng)液，避光孵育30 min。發(fā)射波長515 nm，激發(fā)波長485 nm，激光共聚焦顯微鏡檢測綠色熒光。隨機選取10個視野，分析細胞核平均熒光強度。

1.2.8Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白含量 收集各處理組細胞，RIPA裂解液冰上充分裂解30 min。取上清，BCA法定量蛋白濃度。樣品與上樣緩沖液按比例混合，沸水浴變性。上樣(30-80)μg蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)印2 h至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶10 000比例稀釋的Bax、Bcl-2、β-actin一抗4 ℃孵育過夜。HRP標記二抗孵育2 h。加入ECL-HRP發(fā)光底物，置生物分子成像儀中顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 CsA提高DNR損傷H9c2心肌細胞生存率如Fig 1A所示，12.5-800.0 nmol·L-1CsA處理H9c2細胞26 h，細胞生存率均無顯著性改變(P>0.05vsControl)。

如Fig 1B所示，DNR處理組細胞生存率降至71.71%，25.0、50.0、100.0 nmol·L-1CsA預處理使細胞生存率升至(79.42±5.62)%、(82.15±7.78)%、(88.08±4.80)%(P<0.05vsDNR)。更高濃度CsA處理組細胞生存率較100.0 nmol·L-1CsA處理組略低，但差別無顯著性(P>0.05vs100.0 nmol·L-1CsA+DNR)。

進一步檢測100.0 nmol·L-1CsA 預處理后，不同時間點DNR損傷H9c2心肌細胞生存率。DNR處理6、12、24 h，CsA+DNR組細胞生存率均高于同時期DNR組(P<0.05vsDNR)，整體細胞生存率降幅明顯小于DNR組(Fig 1C)。

上述研究顯示，100.0 nmol·L-1CsA預處理2 h對DNR損傷H9c2心肌細胞生存率提升最為顯著。后續(xù)研究采用100.0 nmol·L-1CsA預處理H9c2心肌細胞，觀察CsA對DNR損傷H9c2細胞心肌損傷指標、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等指標的影響。

2.2 CsA減輕DNR誘導的H9c2細胞損傷

2.2.1CsA改善DNR損傷H9c2心肌細胞形態(tài) 蘇木精-伊紅染色觀察細胞形態(tài)。如Fig 2所示，正常對照組H9c2心肌細胞核質(zhì)境界清晰，呈長梭狀，細胞大小較均勻，形態(tài)規(guī)則，排列整齊。DNR組H9c2細胞失去正常長梭狀形態(tài)，胞體明顯皺縮或膨脹，大小不均，排列紊亂，核質(zhì)固縮及胞質(zhì)空泡化明顯，凋亡小體多見。CsA+DNR組大部分細胞保有梭形的基本形態(tài)，核質(zhì)固縮和胞質(zhì)空泡化有所改善，凋亡小體少見。

Fig 1 Effect of CsA on viability of H9c2 cells treated with DNR

Fig 2 Effect of CsA on morphology of H9c2 cells injured by DNR(Hematoxylin and eosin staining, Bar=50 μm)

2.2.2CsA減少DNR損傷H9c2細胞LDH釋放及CK含量 心肌酶肌酸激酶和乳酸脫氫酶是反映心肌細胞損傷的常用指標。分別檢測培養(yǎng)液上清LDH以及心肌細胞裂解液CK含量，結(jié)果如Tab 1所示：DNR組培養(yǎng)液上清LDH和心肌細胞CK活性較對照組明顯升高(P<0.01vsControl)。CsA+DNR組LDH和CK活性較DNR組明顯降低(P<0.05vsDNR)。

Tab 1 Effect of CsA on LDH and CK activity

2.2.3CsA降低DNR損傷H9c2細胞ANP含量 如Fig 3所示，心房利鈉尿肽是臨床常用的心衰指標。免疫細胞化學結(jié)果顯示，DNR組H9c2心肌細胞胞核和胞質(zhì)呈現(xiàn)ANP陽性的棕黃色深染，平均光密度(IOD·Area-1)較對照組明顯升高(P<0.05vsControl)。CsA+DNR組胞核和胞質(zhì)棕黃色染色明顯低于DNR組(P<0.05vsDNR)，平均光密度與對照組差異無顯著性(P>0.05vsControl)。

Fig 3 Effect of CsA on ANP protein content in DNR injured H9c2 cells

2.3 CsA抑制DNR損傷H9c2心肌細胞ROS生成如Fig 4所示，熒光探針DCFH-DA負載后，激光共聚集顯微鏡檢測心肌細胞ROS熒光值。DNR組DCFH-DA熒光強度明顯升高，是Control組的4倍以上。CsA預處理明顯降低了DNR損傷H9c2心肌細胞ROS含量，CsA+DNR組DCFH-DA熒光強度比DNR降低約64.94%(P<0.001vsDNR)。

Fig 4 Measurement of ROS in H9c2 cells with dichlorofluorescein fluorescence

2.4 CsA減少DNR誘導的H9c2心肌細胞凋亡

2.4.1Hoechst 33342染色 如Fig 5所示，Control組細胞核基本呈現(xiàn)均勻淡藍色，DNR組及CsA+DNR組可見數(shù)量不等的高亮度核染色質(zhì)致密濃染或碎塊狀致密濃染的凋亡細胞，但CsA+DNR組心肌細胞凋亡率較DNR組降低約1/3(P<0.01vsDNR)。

Fig 5 Cellular apoptosis detected by Hoechst 33342 staining in H9c2 cells

2.4.2caspase-3活性檢測 檢測caspase-3活性如Fig 6所示，Control組罕見caspase-3 Substrate綠色熒光的細胞。DNR組和CsA+DNR組H9c2細胞均可見caspase-3活化的綠色熒光。分析caspase-3 Substrate綠色熒光強度，Control組細胞caspase-3 Substrate綠色熒光強度極低，DNR組caspase-3 Substrate綠色熒光強度比Control組升高20倍以上，CsA+DNR組熒光強度較DNR組降低約26%(P<0.01vsDNR)。

Fig 6 Effect of CsA on caspase-3 activity in DNR injured H9c2 cells

2.4.3Bax、Bcl-2蛋白含量 如Fig 7所示，Control、DNR、CsA+DNR組心肌細胞Bax蛋白含量未見顯著性變化。DNR組Bcl-2蛋白含量明顯低于Control組，CsA+DNR組Bcl-2含量較DNR組明顯升高(P<0.05vsDNR)。進一步比較Bax/Bcl-2比值，DNR組Bax/Bcl-2比值約為Control組的6倍，CsA+DNR組Bax/Bcl-2比值較DNR組降低一半以上(P<0.05vsDNR)。

2.5 NFAT參與CsA心肌保護CsA是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)的藥理學抑制劑。T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFATs)是CaN重要的下游底物。我們引入NFAT抑制劑VIVIT多肽，初步分析CsA對DNR損傷H9c2心肌細胞的保護作用是否與CaN-NFAT信號通路有關(guān)。

如Fig 8所示，100.0 μmol·L-1VIVIT多肽處理H9c2細胞2 h，再加入DNR共培養(yǎng)24 h，細胞生存率明顯高于DNR處理組(P<0.01, VIVIT+DNRvsDNR)，與CsA+DNR組差異無顯著性(P>0.05, VIVIT+DNRvsCsA+DNR)。VIVIT多肽處理1 h先行抑制NFAT，再以CsA處理2 h，VIVIT+CsA+DNR處理組細胞生存率與CsA+DNR組及VIVIT+DNR組差異均無顯著性。說明阻斷NFAT背景下，CsA不能再進一步增加DNR損傷H9c2心肌細胞生存率。

Fig 7 Effect of CsA on Bax and Bcl-2 protein content in DNR injured H9c2 cells

Fig 8 Effect of VIVIT peptide on viability of DNR injured H9c2 cells

3 討論

本研究利用DNR損傷H9c2心肌細胞模型，研究CsA對ANT心肌損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)25.0-800.0 nmol·L-1CsA能不同程度提高DNR損傷H9c2大鼠心肌細胞的生存率，25.0-100.0 nmol·L-1濃度區(qū)間內(nèi)具有較好的量效對應(yīng)關(guān)系。CsA還能減少DNR誘導的LDH外漏，降低心肌細胞CK及ANP含量，改善心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果提示，體外條件下CsA減輕了DNR對H9c2心肌細胞的損傷。

有文獻報道，CsA對心臟具有潛在的毒性。CsA心臟毒性具有很強的異質(zhì)性，常在高劑量使用時出現(xiàn)，可導致心肌損傷和纖維化[13]。臨床資料顯示，CsA作為化療增敏劑使用不增加高劑量ANT化療的心臟毒性，對靜息和負荷狀態(tài)的左室射血分數(shù)還具有正向影響[14]。但現(xiàn)有資料尚不足以完全排除AIC背景下CsA心臟毒性的可能。CsA是重要的藥理學工具藥，體外推薦劑量在100 nmol·L-1左右。本研究發(fā)現(xiàn)12.5-800.0 nmol·L-1CsA不降低正常及DNR損傷的H9c2細胞生存率，一定程度提示該劑量范圍內(nèi)CsA不產(chǎn)生額外的心臟毒性，是較為安全的體外用藥區(qū)間。

過度氧化應(yīng)激和細胞凋亡是AIC的主要發(fā)病機制。ANT加劇線粒體內(nèi)的鐵累積與無效氧化還原循環(huán)，增加活性氧的產(chǎn)生。心肌細胞由于線粒體代謝活性高、抗氧化能力低，極易受到ROS的損害。ROS進一步誘導AIC心肌細胞凋亡和壞死，造成正常心肌細胞的大量丟失，加劇心臟結(jié)構(gòu)和功能損害[1]。多種疾病模型中，CsA被發(fā)現(xiàn)能影響線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)，減少ROS生成、抑制細胞凋亡[6, 15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CsA明顯降低了DNR損傷H9c2心肌細胞DCFH-DA熒光強度，抑制ROS生成。隨著ROS水平的降低，CsA處理組H9c2心肌細胞凋亡狀況明顯改善，表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl-2含量增多，Bax/Bcl-2比值明顯減小，caspase-3活化水平和凋亡細胞比例降低。CsA對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響也進一步證明CsA能減輕DNR誘導的心肌細胞損傷。

CsA調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、細胞凋亡、減輕ANT心肌損傷的機制還遠未明確。繼往研究提示其保護作用可能與抑制線粒體膜通透性孔道和多種細胞因子有關(guān)[8, 10]。CsA具有廣泛的藥理學活性，同時也是CaN的藥理學抑制劑，NFAT則是CaN 重要的下游底物。ANT損傷心肌中普遍存在著鈣穩(wěn)態(tài)失衡和鈣處理障礙，[Ca2+]i持續(xù)升高激活CaN的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性，使其下游底物NFAT去磷酸化轉(zhuǎn)位進入細胞核，誘導基因轉(zhuǎn)錄。CaN、NFAT是氧化應(yīng)激和細胞凋亡的重要調(diào)控因子。CaN、NFAT能調(diào)控氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶NADH脫氫酶2/4的轉(zhuǎn)錄，通過Fas/FasL途徑誘導AIC心肌細胞凋亡[16-17]。本研究中CsA的作用與NFAT抑制劑具有一定程度的重疊：以VIVIT多肽阻斷NFAT也能顯著提高DNR處理H9c2細胞生存率；先行阻斷NFAT再給予CsA，則不能進一步提高細胞生存率。上述結(jié)果初步提示CsA的作用還可能與抑制CaN及下游的NFAT有關(guān)。因此，CsA對AIC心肌CaN/NFAT的影響及作用十分值得今后深入探索。

綜上所述，CsA能抑制ROS生成，增加Bcl-2含量，降低caspase-3活性，減少DNR誘導的H9c2心肌細胞凋亡，減少LDH釋放、降低CK含量，改善細胞形態(tài)，提高細胞生存率，對DNR處理的H9c2心肌細胞具有一定的保護作用。以上研究進一步揭示了CsA對蒽環(huán)類藥物心肌損傷的作用，為其在AIC防治中的應(yīng)用提供了有價值的依據(jù)。