新型磷酸二酯酶4抑制劑ZL-n-91對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響

李玉玉，毛 萍，趙正剛，李美蓉，趙夏楠，李芳紅，周素瑾，趙子建

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)[1-2]。2018年流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國神經(jīng)膠質(zhì)瘤的年發(fā)病率為(5-8)個(gè)/10萬，5年死亡率在所有腫瘤中位居第三，僅次于胰腺癌和肺癌[3]。盡管近幾年在膠質(zhì)瘤的診斷和治療方面取得了很大的進(jìn)步，但對于高級別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的預(yù)后仍不理想，患者兩年生存率僅為26%-33%[4]。因此，尋找新型高選擇性的靶向治療藥物極為重要。

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)是PDE家族中重要成員，能夠特異性水解環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)。而腦腫瘤組織中的cAMP水平明顯低于正常腦組織[5]。此外，研究表明[6-7]，PDE4抑制劑咯利普蘭(rolipram)通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平能抑制腦腫瘤的生長，但由于其惡心、嘔吐等嚴(yán)重的副作用而限制了進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用[8-9]。尋找新的副作用小且有效的PDE4抑制劑對腦腫瘤的治療和防治具有重要意義。

ZL-n-91是基于第二代PDE4抑制劑設(shè)計(jì)而成的新型選擇性PDE4抑制劑，對PDE4的抑制作用高于咯利普蘭，且對PDE4B和PDE4D的選擇性是其他PDE家族成員的5 000倍[10]。因此，ZL-n-91具有針對性強(qiáng)，選擇性高，副作用小，能有效減弱甚至避免嘔吐等不良反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)[10]。已有研究表明ZL-n-91對前列腺癌具有一定治療效果[11]。此外，ZL-n-91對阿爾茨海默病等腦損傷具有保護(hù)作用且可有效穿透血腦屏障[12]。因此，本研究利用新型PDE4抑制劑ZL-n-91，通過體內(nèi)外研究探討其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的抑制作用，以期為臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與動物 人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。6周齡，♀，體質(zhì)量(15-20)g的BALB/c-nu裸鼠，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2019-0010。

1.1.2藥物與試劑 ZL-n-91 由藥明康德公司合成；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DMSO購買于美國sigma aldrich；CCK-8(cell counting kit-8，批號：G909FA003)購自上海生物工程有限公司；碘化丙啶(PI，批號：9039585)、PE Annexin V/7-AAD(批號：9074586)試劑購自美國BD公司。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)蛋白(Bax)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、Ki67抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3儀器 AC2-4S1型二級生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國)；流式細(xì)胞儀(DXP AthenaTM，美國)；ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica德國)；CMAXPLUS+酶標(biāo)儀(美國)；-80 ℃冰箱(美菱，中國)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，及時(shí)更換培養(yǎng)液，每2-3 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化并吹打制成細(xì)胞懸液，按所需濃度接種使用。

1.2.2CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活性 將生長良好的U87細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液接種于96 孔板(3×104個(gè)/孔，每孔100 μL)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分為9組：空白對照組，溶劑對照組和50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1的ZL-n-91組。將96孔板過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，更換加入相應(yīng)濃度ZL-n-91藥物的培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免產(chǎn)生氣泡，避光孵育1-2 h，取出，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度(A值)并計(jì)算細(xì)胞增值抑制率，采用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算藥物的IC50。

細(xì)胞增殖率/%=(A給藥組-A空白組)/(A溶劑對照組-A空白組)×100%；

細(xì)胞抑制率/% =[1-細(xì)胞增殖率(%)]×100%

1.2.3PI單染法檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，以2×108個(gè)/L接種于6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，饑餓處理24 h；更換含有血清培養(yǎng)基，加入ZL-n-91(溶劑對照組，150 μmol·L-1，200 μmol·L-1)處理24 h；胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，PBS洗滌離心后，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為0.75的預(yù)冷乙醇，置于-20 ℃固定24 h以上；洗滌離心，按試劑盒說明書加入500 μL PE染色，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期檢測，用ModiFit LT 5.0軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.4PE Annexin V/7-AAD檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，以2×108個(gè)/L接種于6孔培養(yǎng)板；鋪板24 h后，分別加入ZL-n-91(溶劑對照組，150、200、300 μmol·L-1)，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h；消化離心收集細(xì)胞，用1×Binding buffer制備成1×109個(gè)/L的細(xì)胞懸液，分別加入5 μL 7-AAD和5 μL PE染色，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，用Flow Jo V10分析軟件分析結(jié)果。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 用150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91分別處理U87細(xì)胞48 h，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000×g離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。5×上樣緩沖液稀釋，煮沸10 min。取等量蛋白樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加一抗β-actin(1 ∶5 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、CDK2(1 ∶1 000)、CDK4(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育。TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光儀曝光。采用ImageJ軟件分析目的條帶的相對表達(dá)水平。

1.2.6Ki67免疫組織化學(xué)染色 取新鮮腫瘤組織經(jīng)固定、脫水、包埋后制備成石蠟切片，將腫瘤組織切成4 mm切片，經(jīng)60 ℃烤片1.5 h，放入二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，在0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物活性，用正常山羊血清室溫封閉。Ki67抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min、鹽酸酒精分化數(shù)秒、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7動物建模及給藥 小鼠在廣東藥科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫24 ℃，相對濕度45%-55%，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作由廣東藥科大學(xué)動物倫理委員會審查和批準(zhǔn)，動物倫理編號SPF2017027。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

取對數(shù)生長期的U87細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基制備濃度為2.5×1010個(gè)/L的單細(xì)胞懸液接種于雌性裸鼠右側(cè)腋下，每只裸鼠接種0.1 mL(含2.5×106個(gè)細(xì)胞)。待腫瘤體積達(dá)到100 mm3左右時(shí)，將荷瘤小鼠隨機(jī)分組：溶劑對照組和5 mg·kg-1ZL-n-91藥物組。每天進(jìn)行灌胃治療，每兩天測量裸鼠體重、腫瘤體積，計(jì)算腫瘤體積(V=0.52×長徑×寬徑2)，繪制裸鼠體重和腫瘤體積增長曲線。當(dāng)對照組小鼠腫瘤體積達(dá)到1 500 mm3時(shí)，實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，麻醉處死小鼠，剝瘤稱質(zhì)量，拍照。

研究中使用的ZL-n-91為5mg·kg-1由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40% 羥丙基-β-環(huán)糊精和6%聚乙二醇硬脂酸酯溶于生理鹽水配制而成，給藥方式為灌胃給藥。

2 結(jié)果

2.1 ZL-n-91抑制U87細(xì)胞增殖CCK-8檢測不同濃度ZL-n-91(50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1)處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞48 h后，顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)，且隨著ZL-n-91濃度的增加，其抑制增殖的作用進(jìn)一步加強(qiáng)(Fig 1)。計(jì)算ZL-n-91對U87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為274.5 μmol·L-1。以上結(jié)果表明ZL-n-91對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87的增殖具有明顯抑制作用。

2.2 ZL-n-91對U87細(xì)胞周期的影響PI單染檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，150、200 μmol·L-1ZL-n-91處理U87細(xì)胞24 h，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)，S期細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05，P<0.01)(Fig 2A,B)。Western blot結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，ZL-n-91處理組細(xì)胞周期蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1的表達(dá)量下調(diào)(Fig 2C,D)。以上結(jié)果表明ZL-n-91將U87細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

Fig 1 Effect of ZL-n-91 on viability of U87 cells

2.3 ZL-n-91對U87細(xì)胞凋亡的影響利用Annexin V-PE/7-AAD標(biāo)記U87細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91處理后，U87細(xì)胞凋亡程度增加(Fig 3A)，細(xì)胞凋亡率分別是11.08%±3.38%、14.49%±0.46%(P<0.05)、44.12%±5.87%(P<0.01)(Fig 3B)，表明ZL-n-91能夠效誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡且呈現(xiàn)濃度依賴性。Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ZL-n-91藥物處理組抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)沒有明顯差異(Fig 3C)，但Bcl-2/Bax比值下降(Fig 3D;P<0.05)。以上結(jié)果表明ZL-n-91能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的凋亡，可能通過Bcl-2/Bax途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effects of ZL-n-91 on cell cycle distribution of U87 cells

2.4 ZL-n-91對U87裸鼠異種移植瘤生長的影響為了研究ZL-n-91的體內(nèi)抗腫瘤作用，構(gòu)建了U87裸鼠皮下移植瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3左右，隨機(jī)分組開始給藥治療。從給藥d 22起，與溶劑對照組相比，給藥組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組(Fig 4A,P<0.05)。在治療期結(jié)束，剝離腫瘤并稱重，結(jié)果顯示，給藥組小鼠腫瘤重量明顯小于對照組(Fig 4B,C;P<0.01)。在整個(gè)治療期間，兩組小鼠的體重差異無顯著性(Fig 4D)。以上結(jié)果提示，ZL-n-91可以顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞裸鼠移植瘤生長。

2.5 免疫組化檢測Ki67表達(dá)情況Ki67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。免疫組化結(jié)果顯示(Fig 5)，與溶劑對照組相比，給藥組腫瘤組織的Ki67陽性率降低(P<0.01)，該結(jié)果進(jìn)一步表明ZL-n-91能有效抑制膠質(zhì)瘤的增殖。

Fig 3 Effects of ZL-n-91 on cell apoptosis of U87 cells

Fig 4 Effects of 5 mg·kg-1 ZL-n-91 on U87 subcutaneous transplanted tumor

Fig 5 Expression of Ki67 of tumor tissues

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性惡性腫瘤，手術(shù)難以完全切除病灶[13]，而化療藥物治療效果有限，且具有副作用大，易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)[14]。盡管近年來在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方面取得較大的進(jìn)步，但仍缺乏特異性和有效的藥物。本研究首次利用新型的PDE4抑制劑ZL-n-91治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤，通過體內(nèi)外研究證實(shí)其對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有抗腫瘤活性，有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，將U87細(xì)胞阻滯在G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PDE4亞型表達(dá)水平在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著升高，表明PDE4對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長具有正向調(diào)節(jié)作用[6]。由于新型PDE4抑制劑ZL-n-91具有對PDE4的更強(qiáng)的抑制作用、選擇性高、副作用低以及可以通過血腦屏障等優(yōu)勢[10-12]，提示ZL-n-91對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療具有良好的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，ZL-n-91有效的抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，通過體內(nèi)試驗(yàn)證明，每日灌胃5 mg·kg-1ZL-n-91藥物有效抑制裸鼠皮下神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長，且對小鼠沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用，該結(jié)果為ZL-n-91臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供了可能。

本研究發(fā)現(xiàn)ZL-n-91將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期。細(xì)胞周期調(diào)控有多重基因蛋白參與調(diào)控，周期蛋白依賴性激酶(CDK)的表達(dá)及活性是調(diào)控細(xì)胞周期的核心。其中CDK2和CDK4主要作用于G1和S時(shí)期，具有啟動DNA復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用。Cyclin D1通過結(jié)合并激活G1期特有的CDK4，使G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，從而推動細(xì)胞周期由G1進(jìn)入S期[15]。本研究結(jié)果顯示，ZL-n-91能夠明顯下調(diào)CDK2、CDK4、Cyclin D1蛋白的表達(dá)，這也是ZL-n-91將膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期的主要原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)ZL-n-91能夠呈劑量依賴的促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中兩種互為拮抗的凋亡蛋白，通過調(diào)控線粒體膜的通透性在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[16]。Bcl-2可與Bax形成二聚體，兩者的比例失調(diào)是啟動細(xì)胞凋亡的開關(guān)。當(dāng)Bcl-2/Bax比值上調(diào)時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡；反之，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。本研究證實(shí) ZL-n-91可以通過調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值。因此，ZL-n-91可能通過Bcl-2/Bax途徑誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，新型PDE4抑制劑ZL-n-91能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，阻滯周期進(jìn)展，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，本研究為開發(fā)PDE4抑制劑作為抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。