活動(dòng)性結(jié)核病鐵過載小鼠模型建立及相關(guān)指標(biāo)分析

李軍麗，石亞男，占玲俊

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 2新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心 4國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 5結(jié)核病中心，北京100021

鐵是人體必需的微量元素之一，廣泛分布于全身各種組織器官，對(duì)維持人體的各種生理功能和新陳代謝起重要作用。電子傳遞、細(xì)胞呼吸、細(xì)胞增殖與分化等過程中均需要鐵的參與[1]。研究顯示，鐵是病原體毒力和生長的必需微量營養(yǎng)元素[2-4]，機(jī)體鐵負(fù)荷過載與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染宿主后結(jié)核病(tuberculosis，TB)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，機(jī)體鐵過載為胞內(nèi)Mtb生長繁殖和毒力維持提供充足鐵源，可促進(jìn)體內(nèi)Mtb增殖，加速活動(dòng)性TB患者疾病進(jìn)程[5-7]。Isanaka等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TB-人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染者中，高血漿鐵蛋白TB-HIV共感染者死亡風(fēng)險(xiǎn)是非高血漿鐵蛋白TB-HIV共感染者的3倍。對(duì)比活動(dòng)性TB患者、非活動(dòng)性TB患者及健康人群中血清鐵相關(guān)水平發(fā)現(xiàn)，TB的活動(dòng)性與血清鐵水平存在顯著負(fù)相關(guān)[9]。此外研究顯示，鐵過載可通過誘導(dǎo)羥基自由基產(chǎn)生，激活巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激或凋亡信號(hào)通路[10-12]，下調(diào)TB患者抗Mtb防御型Th1反應(yīng)[13-14]，削弱機(jī)體抗Mtb保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而重新激活休眠的Mtb，促使?jié)摲越Y(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的復(fù)燃。盡管鐵過載對(duì)機(jī)體抗結(jié)核免疫應(yīng)答損傷得到了部分闡明，但鐵過載如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)Mtb的生長及其在TB的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。然而，由于臨床患者個(gè)體差異大，取材受限，難以深入研究鐵過載與TB之間的關(guān)系。本研究擬采用外源性鐵過載動(dòng)物模型模擬臨床情況，建立鐵過載TB感染小鼠模型并分析鐵代謝及Mtb相關(guān)指標(biāo)，以期為后續(xù)鐵過載與TB發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

材料和方法

材料6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6N小鼠44只(體質(zhì)量18～20 g)購自北京維通利華[SCXK(京)-2016-0006]。右旋糖酐鐵注射液購自江西創(chuàng)導(dǎo)動(dòng)物保健品有限公司，血清鐵(serum iron，SI)、血清鐵蛋白(serum ferritin，SF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)檢測(cè)試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，組織鐵檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，普魯士藍(lán)染色試劑盒購自北京Solarbio公司，Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為本室保存(菌株號(hào)：93009)，中性羅氏培養(yǎng)管購自珠海貝索生物，BACTEC MGIT 7H9分枝桿菌快速培養(yǎng)管購自美國BD公司。

鐵過載小鼠模型建立采用完全隨機(jī)法將20只C57BL/6N小鼠分為陰性對(duì)照、低劑量、中劑量和高劑量4組，每組5只。低、中、高劑量組分別經(jīng)腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.50、15.00 mg/次，陰性對(duì)照組則經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計(jì)4周。定期觀察小鼠生長及精神狀態(tài)，稱重并記錄。本研究獲中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為：ZLJ2019002。

血清生化指標(biāo)與組織鐵含量測(cè)定建模完成后，小鼠采血并安樂死。外周血4 ℃凝結(jié)過夜，2000g4 ℃離心10 min，分離小鼠血清并檢測(cè) SI、SF、TRF及TfR含量。解剖取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加1 ml生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12 000g4 ℃離心20 min，取上清并測(cè)定總蛋白濃度。血清生化檢測(cè)按試劑盒說明書進(jìn)行，組織鐵測(cè)定則按試劑盒測(cè)定方法計(jì)算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

鐵過載小鼠Mtb感染采用完全隨機(jī)法將24只C57BL/6N小鼠分成空白對(duì)照組、Mtb感染對(duì)照組、中劑量鐵過載模型組和中劑量鐵過載模型Mtb感染組，每組6只。其中，Mtb感染組小鼠經(jīng)尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長期H37Rv單細(xì)胞菌懸液100 μl(1×106CFU/ml)，空白對(duì)照組注射等劑量無菌生理鹽水，于ABSL-3實(shí)驗(yàn)室(國衛(wèi)ABSL3-059)正常飼喂，觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)，感染后4周解剖小鼠。

小鼠組織荷菌量測(cè)定ABSL-3實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物解剖臺(tái)中解剖感染小鼠，取小鼠肺、脾臟和肝臟組織；拍照記錄肺、脾臟和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物安全柜內(nèi)稱重，依次經(jīng)2%稀硫酸溶液、生理鹽水分別漂洗30 s，1 ml生理鹽水溫和勻漿后進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取10-3、10-4和10-5稀釋液50 μl均勻涂布于中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37℃培養(yǎng)4周，計(jì)算相應(yīng)的組織器官荷菌量。另取10-1稀釋液500 μl 接種于BD BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)，通過記錄報(bào)陽時(shí)間進(jìn)行Mtb的快速檢測(cè)。

組織切片HE染色與鐵染色小鼠各組織器官用10%中性福爾馬林溶液固定48 h，組織按長軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成5 μm厚度切片，HE染色后掃描載玻片并保存為NanoZoomer數(shù)字病理圖像，不同視野下拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入Perls染液浸染20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細(xì)胞核10 min，自來水沖洗5 s。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態(tài)改變及鐵沉積程度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

鐵過載小鼠組織形態(tài)及體質(zhì)量評(píng)估鐵過載小鼠外觀與正常小鼠無明顯區(qū)別，自主活動(dòng)穩(wěn)定，精神狀態(tài)平穩(wěn)。解剖后正常小鼠各臟器組織表面光滑，無充血、水腫。鐵過載小鼠肝臟顏色呈暗褐色，且隨著右旋糖酐鐵劑量增加而逐漸加深(圖1)，其他臟器組織無明顯顏色及形態(tài)改變。陰性對(duì)照組，低、中、高劑量組的體質(zhì)量增長百分比分別為25.47%、25.22%、24.74%、21.36%，其中，高劑量組的體質(zhì)量增長明顯低于陰性對(duì)照組(F=17.235，P=0.027)和低(F=15.206，P=0.031)、中劑量組(F=11.061，P=0.036)。

圖1 不同劑量鐵過載小鼠肝臟顏色及形態(tài)變化Fig 1 Liver color and morphology in mice with different doses of iron overload

鐵過載小鼠組織鐵含量變化鐵過載小鼠以肝組織中含鐵量最高，高劑量組的鐵含量較陰性對(duì)照組增加近7倍(F=23.902，P=0.001)，其余組織由高至低依次為脾臟、腎臟、小腸、心臟、肺。中劑量組心臟(F=19.023，P=0.002)、肝臟(F=16.501，P=0.001)、脾臟(F=10.098，P=0.003)、肺(F=12.956，P=0.001)、腎臟(F=17.224，P=0.005)、小腸(F=19.313，P=0.006)組織鐵含量均顯著高于陰性對(duì)照組。

低劑量組小鼠各組織鐵含量中，肝臟(F=20.075，P=0.004)、脾臟(F=11.579，P=0.031)、腎臟(F=10.955，P=0.008)和小腸(F=14.671，P=0.027)顯著高于陰性對(duì)照組，而心臟(F=19.023，P=0.715)和肺(F=23.193，P=0.902)組織鐵含量與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01aP<0.05，bP<0.01 compared with negative control圖2 不同劑量鐵過載小鼠組織鐵含量(n=5)Fig 2 Iron content in tissues of mice with different doses of iron overload(n=5)

鐵過載血生化指標(biāo)變化鐵過載小鼠分別于鐵劑注射4周后取外周血血清進(jìn)行 SI、SF、TRF及TfR檢測(cè)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組SI水平為(19.95±5.64)μmol/L，明顯低于低劑量組的(43.00±6.82)μmol/L(F=23.012，P=0.021)、中劑量組的(65.84±9.31)μmol/L(F=17.479，P=0.007)和高劑量組的(108.45±9.90)μmol/L(F=27.129，P=0.004)；陰性對(duì)照組SF水平為(773.82±161.51)μg/L，明顯低于低劑量組的(1063.68±65.15)μg/L(F=11.057，P=0.031)、中劑量組的(1344.08±168.57)μg/L(F=20.187，P=0.006)和高劑量組的(1694.73±44.45)μg/L(F=17.983，P=0.002)。低(F=10.106，P=0.071；F=23.179，P=0.231)、中(F=9.291，P=0.189；F=11.083，P=0.412)、高劑量組(F=13.102，P=0.271；F=9.232，P=0.397)小鼠的TRF及TfR水平與陰性對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01aP<0.05，bP<0.01 compared with negative control圖3 不同劑量鐵過載小鼠血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平Fig 3 Serum iron，ferritin，transferrin，and transferrin receptor levels in mice with different doses of iron overload

鐵過載小鼠組織HE染色與鐵染色鐵過載模型高劑量組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織HE染色均可見大量團(tuán)狀含鐵血黃素沉積。肝細(xì)胞核固縮、溶解，胞漿內(nèi)滿布蛋白微粒；脾小體與紅髓區(qū)界限不清；小腸及心臟組織可見部分含鐵血黃素沉積，心肌纖維出現(xiàn)排列異常，炎性細(xì)胞浸潤，充血水腫、出血等病理變化；肺部可見少數(shù)鐵蛋白微粒，支氣管和血管周圍及其管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞滲出，并可見肺泡不均勻擴(kuò)張，肺泡間隔斷裂等。中劑量組和低劑量組僅肝臟和脾臟可見含鐵血黃素沉積，且含鐵血黃素沉程度與鐵劑量呈正相關(guān)；心臟、肺、腎臟及小腸等組織未見明顯含鐵血黃素沉積及炎性細(xì)胞浸潤，與陰性對(duì)照組相比無明顯變化(圖4)。普魯士藍(lán)染色與組織鐵含量測(cè)定結(jié)果一致，陰性對(duì)照組小鼠各組織鐵染色為陰性，高劑量組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸等組織大量胞外鐵和胞內(nèi)鐵呈顆粒狀、塊狀亮藍(lán)色鐵沉積。中劑量組肝臟和脾臟組織鐵沉積較明顯，心臟、肺、腎臟和小腸僅可見少量鐵沉積，均未見組織形態(tài)改變。低劑量組小鼠脾臟、腎臟和小腸可見微量鐵沉積，而心臟和肺組織則未見明顯鐵沉積(圖5)。

圖4 不同劑量鐵過載小鼠各組織HE染色Fig 4 HE staining of tissue sections of mice with different doses of iron overload

圖5 不同劑量鐵過載小鼠各組織普魯士藍(lán)染色Fig 5 Prussian blue staining of tissue sections of mice with different doses of iron overload

鐵過載結(jié)核病小鼠組織荷菌量中劑量右旋糖酐鐵建立的鐵過載小鼠模型進(jìn)行Mtb感染實(shí)驗(yàn)，感染后4周解剖并進(jìn)行肺、脾臟和肝臟病理分析和荷菌量檢測(cè)，結(jié)果顯示，鐵過載結(jié)核病小鼠模型構(gòu)建成功。肺、脾臟及肝臟組織病理HE染色中鐵過載Mtb感染組肺組織出現(xiàn)多處結(jié)核感染性炎癥反應(yīng)，呈實(shí)變趨勢(shì)，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞填充，結(jié)核性病變顯著增加且多于Mtb感染對(duì)照組。脾臟白髓呈結(jié)核感染樣病變，可見炎癥細(xì)胞聚集，且病變較Mtb感染對(duì)照組嚴(yán)重。同樣，鐵過載Mtb感染小鼠肝臟可見水腫、淤血，光鏡下肝細(xì)胞內(nèi)可見團(tuán)塊狀鐵褐色沉積，Mtb感染后出現(xiàn)多個(gè)散在小肉芽腫樣病變，可見鐵過載肝臟病理改變和結(jié)核感染性病理特征(圖6)。鐵過載Mtb感染組的肺(F=23.227，P=0.017)、脾臟(F=19.023，P=0.021)和肝臟(F=17.392，P=0.009)的細(xì)菌培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間明顯低于Mtb感染對(duì)照組，肺(F=21.012，P=0.007)、脾臟(F=20.173，P=0.002)和肝臟(F=19.091，P=0.005)的荷菌量明顯高于Mtb感染對(duì)照組(圖7)。

討 論

隨著對(duì)鐵代謝的深入研究，鐵缺乏不再是被關(guān)注的唯一問題，人們對(duì)機(jī)體鐵負(fù)荷過載所引發(fā)的健康問題也越來越重視。臨床上先天性代謝障礙可導(dǎo)致體內(nèi)鐵過度蓄積，持續(xù)性大量輸血、長期內(nèi)服鐵劑或某些血液性疾病也可導(dǎo)致機(jī)體鐵負(fù)荷過載[15-16]。鐵作為催化劑在氧化還原反應(yīng)中進(jìn)行電子交換，這既是機(jī)體許多生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，也是鐵毒性作用的基礎(chǔ)[17]。鐵過載不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，對(duì)于疾病治療效果、生存及預(yù)后也極為不利[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體鐵過載與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是鐵過載與TB發(fā)病機(jī)制目前已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[20-23]。

本研究通過給小鼠定期定量腹腔注射右旋糖酐鐵以構(gòu)建鐵過載模型。鐵劑注射量最高達(dá)到15.00 mg/次，小鼠均未出現(xiàn)高鐵不耐受導(dǎo)致死亡的情況，說明給鐵劑量和小鼠品系選擇的可行性。從SI、SF及各組織鐵元素測(cè)定結(jié)果來看，小鼠體內(nèi)鐵沉積量隨著鐵劑注射量的增加而明顯增高，且組內(nèi)小鼠之間的鐵含量檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性良好，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[24-25]。不同劑量鐵過載小鼠TRF及TfR水平未見明顯變化，推測(cè)與長期鐵劑注射致機(jī)體對(duì)鐵元素的吸收和利用達(dá)到飽和，同時(shí)與體內(nèi)鐵反應(yīng)元件和鐵調(diào)節(jié)蛋白等活性改變，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TfR1的表達(dá)有關(guān)。鐵過載小鼠肝臟、脾臟等組織均可見一定量的鐵沉積，符合鐵過載疾病臨床患者的肝脾病理表現(xiàn)[26]。模型實(shí)驗(yàn)中，高劑量鐵導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增長減緩，同時(shí)出現(xiàn)肝臟和腎臟等病理損傷，而低劑量組小鼠心臟和肺組織經(jīng)普魯士藍(lán)染色并未觀察到明顯的鐵沉積，與陰性對(duì)照組無明顯差異。因此，建議后續(xù)鐵過載小鼠造模中給予中等劑量鐵劑注射，特別是構(gòu)建鐵過載模型用于肺部疾病等研究。

箭頭指示結(jié)核感染病變處Arrows show the lesions of tuberculosis infection圖6 結(jié)核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織病理變化(HE)Fig 6 Pathological changes of lung，spleen and liver in iron-overloaded mice with tuberculosis infection(HE)

與右旋糖酐鐵結(jié)核感染組比較，aP<0.05，bP<0.01aP<0.05，bP<0.01 compared with H37Rv+iron dextran group圖7 結(jié)核感染鐵過載小鼠肺、脾臟、肝臟組織荷菌量分析Fig 7 The bacterial loads in the lung，spleen and liver of iron-overloaded mice with tuberculosis infection

大量鐵元素在重要臟器組織內(nèi)沉積，尤其是肝臟、脾臟和腎臟等，導(dǎo)致各個(gè)臟器功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[27-28]。這種損傷可進(jìn)一步加重原發(fā)性或繼發(fā)性鐵過載，如地中海貧血、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血等人群對(duì)Mtb的易感性[29]。為了進(jìn)一步闡明鐵過載與TB發(fā)生發(fā)展的機(jī)制關(guān)系，本研究在鐵過載小鼠模型構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上進(jìn)行了活動(dòng)性TB鐵過載小鼠模型的建立。從Mtb感染小鼠的肺、脾臟和肝臟病理表征來看，活動(dòng)性TB模型構(gòu)建成功。感染后4周，小鼠肺、脾和肝臟均出現(xiàn)明顯結(jié)核樣病變，且各靶器官組織分離出大量Mtb。同時(shí)，鐵過載Mtb感染組荷菌量高于Mtb感染對(duì)照組靶器官，這也符合鐵過載人群TB易感的臨床特征。

綜上，本研究采用腹腔注射右旋糖酐鐵成功建立了與臨床上原發(fā)性鐵過載患者情況基本相符的鐵過載小鼠模型。通過血生化、組織鐵以及組織病理檢測(cè)分析等手段驗(yàn)證了該模型，進(jìn)一步Mtb感染后成功構(gòu)建了活動(dòng)性TB鐵過載小鼠模型。這為以后深入研究鐵過載與其他復(fù)雜和異質(zhì)性疾病發(fā)病機(jī)制以及推進(jìn)新藥發(fā)展和臨床新治療方案的評(píng)估奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，也為鐵過載與活動(dòng)性TB發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>