柳州地區(qū)部分孕產(chǎn)婦B族鏈球菌的耐藥性與分子特征分析

陳燕群 1,陳繼昌 2,吳宇碧

（柳州市婦幼保健院 1.檢驗(yàn)科；2.新生兒科；3.產(chǎn)科，廣西柳州 545001）

B族鏈球菌（group BStreptococcus，GBS）在正常情況下可定植于孕產(chǎn)婦的生殖道，約10%的孕產(chǎn)婦生殖道可檢出GBS[1]。GBS是一種機(jī)會(huì)性病原體，可在分娩前或分娩時(shí)通過(guò)垂直傳播感染新生兒，導(dǎo)致發(fā)生早發(fā)型GBS感染（early-onset group B streptococcus，EOGBS）等，此類感染與新生兒的感染性疾病發(fā)病率與死亡率高度相關(guān)[2?3]。產(chǎn)前抗生素預(yù)防（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）對(duì)新生兒的管理非常重要，因而需要對(duì)產(chǎn)前GBS陽(yáng)性菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)以選擇敏感藥物進(jìn)行預(yù)防性用藥[2]。此外，GBS擁有大量毒力因子，可附著于宿主細(xì)胞，從而導(dǎo)致宿主發(fā)生侵襲或定植，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)一步進(jìn)展[3?4]。為全面了解本地區(qū)從孕產(chǎn)婦樣本分離的GBS菌株抗菌藥物敏感性、毒力基因和耐藥基因的分布情況，我院對(duì)分離的96株菌株進(jìn)行了相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 研究方法

1.1 研究人群和樣本收集

收集2019年1月?8月在我院分娩的、分娩前2周內(nèi)無(wú)抗菌藥物使用情況，且無(wú)發(fā)生急性、明顯性感染孕產(chǎn)婦1 452名，納入和排除標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。在分娩前，采集陰道分泌物，半小時(shí)內(nèi)送至檢驗(yàn)科微生物室進(jìn)行處理。上述樣本監(jiān)測(cè)和采集的過(guò)程，獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批文為（20170010）。

1.2 GBS的分離鑒定

將陰道分泌物拭子轉(zhuǎn)種至GBS顯色鑒定培養(yǎng)基中，在35～37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，將顯色陽(yáng)性的菌落（經(jīng)顯色后出現(xiàn)紅色、粉紅色或淺紫色）經(jīng)進(jìn)一步的革蘭染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)確定為可疑陽(yáng)性后，轉(zhuǎn)種至哥倫比亞羊血培養(yǎng)皿中進(jìn)行CAMP試驗(yàn)，觀察溶血環(huán)狀態(tài)，鑒定分離株為GBS后行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和分子生物學(xué)分析。

1.3 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

取陽(yáng)性純培養(yǎng)菌落，使用微量稀釋法試驗(yàn)對(duì)GBS菌株進(jìn)行藥物敏感性分析，按照卡片的說(shuō)明書操作進(jìn)行。折點(diǎn)的判讀基于美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提供的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。對(duì)于青霉素耐藥菌株，進(jìn)一步使用E-tes t方法進(jìn)行復(fù)核?？咕幬锒嘀啬退帲╩ultidrug resistance，MDR）的判定標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)≥3種不同種類的抗菌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥[6]。

1.4 耐藥基因和毒力基因檢測(cè)

取純培養(yǎng)菌落，提取DNA后，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和林可酰胺類抗菌藥物的耐藥基因：ermA、ermB、ermTR、mefA/E、tetM、tetO、tetL、tetK、tetT、tetS和linB。采用PCR方法檢測(cè)GBS的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon），耐藥基因和毒力基因檢測(cè)的方法和試劑盒的使用均參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

GBS顯色鑒定培養(yǎng)基和哥倫比亞羊血培養(yǎng)皿均購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司，規(guī)格為90 mm。菌株藥敏實(shí)驗(yàn)儀器選擇法國(guó)梅里埃的VITEK COMPACT 2，藥敏卡片選擇GP67卡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBMSPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，連續(xù)型數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料和率的差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕產(chǎn)婦GBS定植的臨床特征分析

本研究最終納入了1 452名孕產(chǎn)婦檢測(cè)GBS，檢出96株GBS菌株，其陰道攜帶率為6.6%。在GBS檢出的陽(yáng)性婦女群體，低分娩孕周與孕產(chǎn)婦妊娠合并癥/不良妊娠結(jié)局有關(guān)（P=0.004），見(jiàn)表1。

表1 孕產(chǎn)婦GBS定植的臨床特征分析Table 1 Analysis of clinical characteristics of GBSisolated in pregnant women[n(%)]

2.2 孕產(chǎn)婦GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關(guān)系分析

96例GBS菌株，共檢測(cè)出3種血清型，分別為Ⅰa（41.7%）、Ⅰb（22.9%）和Ⅲ型（35.4%）。GBS多重耐藥率為86.5%，菌株抗菌藥物耐藥率最高者為紅霉素（99.0%）、克林霉素（96.9%）、四環(huán)素（86.5%）和左氧氟沙星（65.6%），主要的耐藥模式為：紅霉素?克林霉素?四環(huán)素、紅霉素?克林霉素?四環(huán)素?左氧氟沙星、紅霉素?克林霉素?四環(huán)素?氯霉素、紅霉素?克林霉素?氯霉素等4種。其中氯霉素的耐藥率在3種血清型中的分布存在顯著差異，以Ⅰb型的耐藥率為最高（P=0.017）。alphaC基因在血清Ⅰa型菌株的陽(yáng)性率最高（P<0.001），rib基因在血清型Ⅲ的菌株中陽(yáng)性率最高（P<0.001），epsilon基因在血清型Ⅰb的菌株陽(yáng)性率最高（P=0.015，具體見(jiàn)表2。

表2 孕產(chǎn)婦GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關(guān)系分析Table 2 Analysis of the relationship between the serotypes,drug resistance and virulence genes of GBSstrains isolated in pregnant women[n(%)]

2.3 GBS菌株血清型與毒力基因的對(duì)應(yīng)分析

對(duì)應(yīng)分析結(jié)果顯示，GBS菌株的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsi‐lon基因）檢出率與血清型分布存在差異性（χ2=56.78，P<0.001）。表現(xiàn)為血清型Ⅲ菌株更容易攜帶毒力基因rib，血清型Ⅰa菌株更容易攜帶毒力基因alphaC，血清型Ⅰb菌株更容易攜帶毒力基因epsi‐lon，見(jiàn)圖1。

圖1 GBS菌株血清型與毒力基因分布的對(duì)應(yīng)分析Figure 1 Correspondence analysis of GBS strain serotypes and virulence gene distribution

3 討論

GBS是新生兒疾病發(fā)生和死亡的主要致病原因之一，尤其在出生后的1周內(nèi)[8]。全球范圍內(nèi)每年至少有350萬(wàn)早產(chǎn)發(fā)生的主要原因可歸因于母親GBS感染/定植。在中低收入國(guó)家，報(bào)告的GBS發(fā)病率數(shù)據(jù)更容易產(chǎn)生報(bào)告偏倚/發(fā)表偏倚。在亞洲，這個(gè)數(shù)據(jù)更是被嚴(yán)重低估。在一個(gè)成本效益建模報(bào)告中，披露的數(shù)據(jù)表明，亞洲EOGBS發(fā)病絕對(duì)數(shù)很高，但母親GBS定植率較低，表明疾病的發(fā)病率被嚴(yán)重低估。文獻(xiàn)指出，這些差異有可能是因?yàn)樵谠摰貐^(qū)流行的GBS菌株毒力很可能有所不同。一些文獻(xiàn)報(bào)道，與血清型Ⅲ密切相關(guān)的高毒力GBS菌株ST17既可能在孕產(chǎn)婦生殖道定植，也可能導(dǎo)致新生兒疾病的發(fā)生[8]。

IAP可預(yù)防每年3 000例新生兒的死亡[8]。本研究結(jié)果顯示，96株GBS菌株藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果不樂(lè)觀，有86.5%的菌株產(chǎn)生了多重耐藥，最常見(jiàn)的耐藥表型是紅霉素?克林霉素?四環(huán)素和紅霉素?克林霉素?四環(huán)素?左氧氟沙星。孕產(chǎn)婦中分離的GBS菌株對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素的高耐藥率在國(guó)內(nèi)也多次被報(bào)道[9?10]。國(guó)外研究顯示，GBS菌株對(duì)四環(huán)素的耐藥率高達(dá)94.9%[11]。且有15%的菌株對(duì)青霉素產(chǎn)生了耐藥性[11]，且菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物的敏感性正在下降[12]。該研究發(fā)現(xiàn)從孕產(chǎn)婦陰道分泌物中分離出的GBS菌株中有30.8%對(duì)萬(wàn)古霉素產(chǎn)生了耐藥性，且特定的血清型別與青霉素、萬(wàn)古霉素的耐藥性存在高度相關(guān)性，如血清型別Ⅱ、V對(duì)青霉素的耐藥性分別為33%和27%，而Ⅴ型對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率高達(dá)45%[11]。本研究結(jié)果顯示，從孕產(chǎn)婦陰道分泌物樣本中分離的GBS菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類抗菌藥物均敏感，對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素和替加環(huán)素等均100%敏感，表明上述藥物仍可作為IAP的首選藥物。臨床使用抗菌藥物對(duì)有高危因素需進(jìn)行產(chǎn)前抗生素預(yù)防用藥前，需進(jìn)行皮試，對(duì)皮試結(jié)果陽(yáng)性者，應(yīng)使用敏感的抗菌藥物，達(dá)到預(yù)防的效果。

本研究結(jié)果顯示，在96株GBS菌株中，有57株菌株至少攜帶了1～3種大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的基因。高攜帶率的ermB和mefA/E的結(jié)果表明此兩種耐藥基因可能是GBS對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了誘導(dǎo)型大環(huán)內(nèi)酯?林可酰胺?鏈霉菌素B（iMLSB）菌株同時(shí)攜帶ermB和mefA/E[13]。且該文獻(xiàn)結(jié)果顯示，ermTR和iMLSB高度相關(guān)。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，40.6%（39/96）的菌株攜帶了ermB和mefA/E，且84.4%（81/96）的菌株表明GBS菌株的高耐藥基因陽(yáng)性，凸顯了在日常工作中持續(xù)對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥監(jiān)測(cè)的必要性。

目前研制的疫苗中，若90%的母親接種GBS疫苗有80%左右的有效率，可保護(hù)約108 000名胎兒或新生兒免于死亡[11]。對(duì)本地區(qū)分離的GBS菌株進(jìn)行持續(xù)性監(jiān)測(cè)，可快速得知本土流行菌株的血清型，且為日后研制GBS疫苗提供依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，本地流行的GBS菌株血清型只有3種，Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型（分別占41.7%、22.9%和35.4%），與國(guó)內(nèi)華南地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果及與國(guó)外的研究不一致[9，11]，表明血清學(xué)分布具有地域性差異。正在研制的3聯(lián)苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）血清覆蓋率達(dá)到100%，凸顯了早日引進(jìn)該類疫苗到本地區(qū)進(jìn)行接種的重要性。

已有較多文獻(xiàn)報(bào)道了GBS菌株的毒力基因在不同的血清型別中的差異性[14]。對(duì)GBS菌株進(jìn)行持續(xù)性的監(jiān)測(cè)可得知菌株的進(jìn)化程度和遺傳背景差異性[15?17]。本研究針對(duì)常見(jiàn)的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon基因）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，GBS菌株對(duì)alp2/3、al‐phaC、rib和epsilon基因的攜帶率分別為3.1%、30.2%、32.3%和34.4%。且對(duì)應(yīng)分析結(jié)果顯示，菌株的血清型別與alp表面蛋白抗原相關(guān)基因存在高度相關(guān)性。alp表面蛋白抗原相關(guān)疫苗（alphaC和rib）和3聯(lián)苗（alphaC、rib和epsilon）的覆蓋率分別為62.5%和96.9%，表明本土流行菌株的毒力基因與三聯(lián)苗覆蓋率高度吻合，引進(jìn)alp表面蛋白抗原相關(guān)三聯(lián)苗亦可預(yù)防絕大多數(shù)GBS定植陽(yáng)性的孕產(chǎn)婦通過(guò)垂直傳播將菌株傳染給新生兒，從而減少EOGBS和死胎死產(chǎn)等，其成本效益較好。

本研究對(duì)柳州地區(qū)圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦陰道定植的GBS菌株進(jìn)行了抗菌藥物敏感性試驗(yàn)、紅霉素和四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)、菌株的血清分型，并對(duì)alp表面蛋白抗原相關(guān)基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)本地流行的GBS菌株大多呈現(xiàn)多重耐藥性，國(guó)際上正在研發(fā)的血清三聯(lián)苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）和alp表面蛋白抗原相關(guān)三聯(lián)苗的覆蓋率分別達(dá)100%和96.9%。本研究結(jié)果表明，對(duì)本地區(qū)孕產(chǎn)婦進(jìn)行持續(xù)性GBS篩查和監(jiān)測(cè)的必要性，凸顯了及時(shí)對(duì)分離的GBS菌株進(jìn)行血清分型和相關(guān)毒力基因監(jiān)測(cè)的重要性。