無瓣海桑內(nèi)生真菌Aspergillus sp.ZJ-S4生物堿類次級代謝產(chǎn)物的分離鑒定及抗炎活性

劉紅菊 1，閆沖 1，佘志剛

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523808；2.中山大學(xué)化學(xué)院，廣東廣州 510275）

生物堿是一類天然存在的含氮堿性有機化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜并具有廣泛的生物活性，具有抗感染、鎮(zhèn)痛[1-3]、抗腫瘤[4-5]以及抗菌[6-7]等藥理作用。生物堿最初是從植物中發(fā)現(xiàn)的，近年來在可培養(yǎng)微生物中分離出多種生物堿[3,8-9]，這為其可持續(xù)生產(chǎn)提供了機會。探索多樣性和研究較少的環(huán)境，尋找能夠產(chǎn)生生物活性天然產(chǎn)物的新微生物菌株具有重要意義。近年來，從溶巖洞穴[10]、海洋[11]、特殊環(huán)境內(nèi)生真菌[12]等特殊環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜、新穎的化合物。典型環(huán)境中的微生物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物已是發(fā)現(xiàn)新藥物和先導(dǎo)化合物的重要來源。

紅樹林生長環(huán)境獨特，所處的高溫、高鹽、頻繁潮汐、缺氧、強風、強紫外線的生態(tài)條件，為植物內(nèi)部共生的微生物提供了獨特的生活環(huán)境，蘊藏著豐富并具有特色的微生物資源[13]。本課題組長期致力于紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的分離和活性研究，得到了多種重要的具有抗結(jié)核、抗感染、抗Ⅱ型糖尿病以及抗腫瘤等活性的次級代謝物[14]。本研究從一株無瓣海桑（Sonneratia apetala）的新鮮果實中分離得到了一株曲霉屬真菌，在其大米培養(yǎng)基中分離得到了11個吲哚類生物堿，部分化合物顯示了較好的體外抗炎活性。

1 儀器與材料

1.1 樣品及菌株鑒定

菌株Aspergillussp.ZJ-S4采集于廣東徐聞珊瑚礁國家級自然保護區(qū)，由紅樹植物無瓣海桑（Son‐neratia apetala）的新鮮果實中分離得到。通過用真菌ITS間隔序列所得到的堿基序列在Genebank中用Blast進行相似性分析，與菌株Aspergillus clava‐tonanicus（AF459727.1）有99%的相似度，鑒定為曲霉屬真菌Aspergillussp.。該菌株目前保藏在中山大學(xué)化學(xué)院天然產(chǎn)物研究室。

1.2 儀器與試劑

AVANCE III 400/500 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker Biospin公司）；DSQ EI-MS質(zhì)譜儀（美國Thermofisher公司）；MAT95XPHR-EI-MS質(zhì)譜儀（美國Thermofisher公司）；LCQ DECA XPLC-MS質(zhì)譜儀（美國Thermofisher公司）；TSQ Quantum Ul‐tra HR-LC-MS質(zhì)譜儀（美國Thermofisher公司）；Agilent HP 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Ultimate?XB-C18（250 mm×10 mm，5μm）色譜柱;Chiralpak AY-H（250 mm×4.6 mm，5μm；Daicel Chemical Industries，Ltd.）。薄層層析GF254硅膠板（青島海洋化工廠）；200～300目柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（GE Healthcare公司）；ODS色譜填料（日本YMC公司）；氘代試劑（美國Sigma公司）；Synergy z BioTek多功能酶標儀（美國BioTek公司）；脂多糖（LPS）、3-（4,5-dimethyl-2-thi‐azolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide（MTT）細胞增殖和毒性檢測試劑盒（美國sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清（澳大利亞HYPCOL公司）；一氧化氮檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；實驗所用其他試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。

2 方法

2.1 提取與分離

菌株在25℃條件下用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d后，所得菌絲和大米培養(yǎng)基用等體積的乙酸乙酯提取3次，濃縮得到32.6 g粗浸膏。所得粗浸膏通過柱層析硅膠（200～300目)進行初步分離，以乙酸乙酯-石油醚為流動體系，在20∶80～100∶0（體積比）范圍內(nèi)進行梯度洗脫，收集得到7段組分（Fr.1-Fr.7）。Fr.2經(jīng)硅膠柱層析法（乙酸乙酯-石油醚，體積比30∶70）分離純化后得到5段組分（Fr.2.1-Fr.2.5），F(xiàn)r.2.3經(jīng)葡聚糖凝膠sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，體積比1∶1）2次分離純化后得到化合物3（8 mg）和4（7 mg）；Fr.3經(jīng)硅膠柱層析法（乙酸乙酯-石油醚，體積比40∶60）分離純化后得到5段組分（Fr.3.1～Fr.3.5)，F(xiàn)r.3.2經(jīng)高效液相色譜法（2 mL/min，甲醇-水，體積比65∶35）進行分離純化后得到化合物5（8 mg）和6（7 mg），F(xiàn)r.3.3經(jīng)高效液相色譜法（2 mL/min，甲醇-水，體積比70∶30）進行分離純化后得到化合物7（11 mg）、8（10 mg）和9（10 mg）；Fr.4經(jīng)硅膠柱層析法（乙酸乙酯-石油醚，體積比40∶60）分離純化后得到6段組分（Fr.4.1-Fr.4.6），F(xiàn)r.4.2經(jīng)高效液相色譜法（2 mL/min，甲醇-水，體積比60∶40）進行分離純化后得到化合物1（6 mg）和2（8 mg），F(xiàn)r.4.3經(jīng)葡聚糖凝膠sephadex LH-20（三氯甲烷-甲醇，體積比1∶1）2次分離純化后得到化合物10（10 mg）和11（5 mg）。

2.2 化合物對NO生成量的影響

取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，按1×105個/孔接種于96孔板，100μL/孔。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁并進入對數(shù)生長期，更換新的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM），加入LPS（終濃度1μg/mL）和樣品溶液或吲哚美辛溶液，每個濃度設(shè)3孔重復(fù)。陽性對照組只加LPS不加藥物，陰性對照組只加細胞和完全培養(yǎng)基，空白孔只加完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取細胞培養(yǎng)上清液50μL加入新的96孔板，再分別加入NO檢測試劑Ⅰ與Ⅱ各50μL。用酶標儀測定540 nm處的吸光度。

2.3 化合物對細胞活力的影響

取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，按1×105個/孔接種于96孔板，100μL/孔。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁并進入對數(shù)生長期，更換新的完全培養(yǎng)基，加入LPS（終濃度1μg/mL）和樣品溶液或吲哚美辛溶液，每個濃度設(shè)3孔重復(fù)。陽性對照組只加LPS不加藥物，陰性對照組只加細胞和完全培養(yǎng)基，空白孔只加完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入1 mg/mL的MTT溶液50μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基和MTT，再向各孔中加入150μL的DMSO，震蕩混勻，用酶標儀測定490 nm處的吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色固體；HR-ESI-MSm/z502.209 75[M-H]?(calcd.for C27H28N5O5,502.209 04)；分子式C27H29N5O5。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ：8.34(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，7.84(1H，m，H-6)，7.57(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.75(1H，d，J=8.1 Hz，H-8)，5.72(1H，d，J=5.5 Hz，H-11)，2.94(1H，dd，J=15.2,7.7 Hz，H-12)，3.05(1H，dd，J=15.3，3.1 Hz，H-12)，5.08(1H，s，H-14)，7.50(1H，d，J=7.7 Hz，H-18)，7.32(1H，t，J=7.7 Hz，H-19)，7.1(1H，t，J=7.6 Hz，H-20)，7.36(1H，d，J=7.8 Hz，H-21)，3.16(1H，dt，J=13.8，6.9 Hz，H-23)，1.24(3H，d，J=7.1 Hz，H-24)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，H-25)，1.33(3H，s，H-26)，1.29(3H，s，H-27)，6.82(1H，br s，2-OH)。13CNMR(125 MHz,CDCl3)δ：170.1(C-1)，85.0(C-2)，150.4(C-3)，146.9(C-4)，128.0(C-5)，135.2(C-6)，127.8(C-7)，127.2(C-8)，120.8(C-9)，161.0(C-10)，52.6(C-11)，41.0(C-12)，74.9(C-13)，79.1(C-14)，65.4(C-15)，175.3(C-16)，137.5(C-17)，115.6(C-18)，130.5(C-19)，125.3(C-20)，124.2(C-21)，137.7(C-22)，36.0(C-23)，14.8(C-24)，18.0(C-25)，25.6(C-27)，24.4(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的基本一致，故鑒定化合物1為epi-fiscalin E。

化合物2：白色固體；EI-MS：m/z486[M+H]+；分子式C27H27N5O4。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.69(1H，d，J=8 Hz，H-5)，7.77(1H，m，H-6)，7.57(1H，dd，J=18.0，7.8 Hz，H-7)，8.30(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)，5.83(1H，dd，J=8.3，4.4 Hz，H-11)，2.65(1H，dd，J=14.6，4.4 Hz，H-12)，2.29(1H，dd，J=14.5,8.4 Hz，H-12)，5.08(1H，s，H-14)，7.50(1H，dd，J=18.0，7.8 Hz，H-18)，7.32(1H，t，J=7.5 Hz，H-19)，7.07(1H，t，J=7.5 Hz，H-20)，7.26(1H，d，J=4.1 Hz，H-21)，2.42(3H，s，H-24)，2.01(3H，s，H-25)，1.42(3H，s，H-26)，1.55(3H，s，H-27)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：168.3(C-1)，120.9(C-2)，145.7(C-3)，147.1(C-4)，127.7(C-5)，134.9.2 (C-6)，127.6(C-7)，127.1(C-8)，120.0(C-9)，160.5(C-10)，51.4(C-11)，40.3(C-12)，74.2(C-13)，78.4(C-14),64.9.4 (C-15)，175.3(C-16)，138.1(C-17)，115.9(C-18)，130.2(C-19)，125.3(C-20)，1241(C-21)，137.6(C-22)，132.4(C-23)，22.0(C-24)，21.2(C-25)，26.5(C-27)，25.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的一個未命名的半合成化合物結(jié)構(gòu)一致，因此確定化合物2為新的天然產(chǎn)物，命名為quinadoline D。

化合物3：白色固體；HR-ESI-MS：m/z505.208 31[M+H]+(calcd.for 505.208 71)，分子式為C27H29N5O5。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ：5.4(1H，d，J=2.3 Hz，H-2)，8.32(1H，d，J=7.10 Hz，H-5)，7.83(1H，m，H-6)，7.55(1H，t，J=8.82 Hz，H-7)，7.76(1H，t，J=8.08 Hz，H-8)，6.14(1H，d，J=9.52 Hz，H-11)，2.40(1H，d，J=14.89 Hz，H-12)，3.05(1H，dd，J=10.14，15.07 Hz，H-12)，5.19(1H，s，H-14)，7.54(1H，d，J=8.45 Hz，H-18)，7.10(1H，t，J=7.56 Hz，H-19)，7.34(1H，t，J=7.68 Hz，H-20)，7.26(1H，d，J=7.33 Hz，H-21)，3.13(1H，m，H-23)，1.09(3H，d，J=6.7 Hz，H-24)，1.34(3H，d，J=7.1 Hz，H-25)，1.61(3H，s，H-26)，1.50(3H，s，H-27)，8.61(1H，br s，N-OH)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ：167.7(C-1)，80.9(C-2)，147.4(C-3)，146.6(C-4)，127.3(C-5)，135.4(C-6)，128.2(C-7)，127.8(C-8)，120.3(C-9)，162.2(C-10)，51.5(C-11)，39.4(C-12)，76.2(C-13)，86.5(C-14),71.1(C-15)，172.3(C-16)，136.3(C-17)，116.3(C-18)，125.3(C-19)，130.6(C-20)，123.4(C-21)，137.3(C-22)，29.0(C-23)，15.2(C-24)，19.7(C-25)，18.2(C-27)，23.0(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致，故鑒定化合物3為quinadoline A。

化合物4：白色針晶；EI-MS：m/z439[M]+；分子式為C25H21N5O3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.33(1H，dd，J=8.0，1.2 Hz，H-8)，7.92(1H，d，J=3.6 Hz，N-H)，7.78(1H，ddd，J=8.5，7.2，1.5 Hz，H-6)，7.67(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，7.55(1H，d，J=8.0 Hz，H-24)，7.49(1H，d，J=7.4 Hz，H-21)，7.34(1H，td，J=7.7，1.1 Hz，H-22)，7.15(1H，td，J=7.7，1.1 Hz，H-23)，5.75(1H，dt，J=3.8，1.8 Hz，H-11)，4.98(1H，d，J=1.2 Hz，H-14)，4.64(1H，d，J=5.5 Hz，H-2)，3.81(1H，ddd，J=8.8，4.0，1.0 Hz，H-18)，3.04(2H，dd，J=13.9，3.9 Hz，H-12)，2.40(1H，m，H-15)，1.98(1H，m，H-17)，1.89(1H，m，H-17)，1.82(1H，m，H-15)，1.47(2H，m，H-16)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：174.2(C-19)，171.1(C-1)，159.0(C-10)，151.1(C-3)，147.3(C-4)，137.9(C-20)，137.1(C-25)，135.0(C-6)，127.8(C-7)，129.7(C-22)，127.5(C-8)，127.4(C-5)，126.8(C-23)，124.0(C-24)，117.0(C-21)，121.2(C-9)，92.0(C-14)，69.6(C-18)，61.0(C-2)，56.6(C-15)，53.7(C-13)，53.1(C-11)，34.1(C-12),29.8(C-17)，25.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致，故鑒定化合物4為quinadoline B。

化合物5：白色固體；EI-MSm/z432[M]+，分子式為C23H20N4O5。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：5.23(1H，s，H-2)，7.81(1H，d，J=7.6 Hz,H-5)，7.34(1H，t，J=7.5 Hz，H-6)，7.54(1H，t，J=7.6 Hz，H-7)，7.49(1H，d，J=7.7 Hz，H-8)，5.57(1H，t，J=10.0 Hz，H-12)，3.43(1H，dd，J=11.1，13.1 Hz，H-13a)，3.05(1H，dd，J=9.4，13.2 Hz，H-13b)，8.77(1H，s，OH-16)，8.23(1H，d，J=7.9 Hz，H-20)，7.63(1H，t，J=7.5 Hz，H-21)，7.91(1H，t，J=7.6 Hz，H-22)，7.75(1H，d，J=8.1 Hz，H-23)，8.55(1H，s，H-26)，1.34(3H，s，H-27)，1.23(3H，s，H-28)。13C NMR(125 MHz,DMSO)δ：86.7(C-2)，84.0(C-3)，132.9(C-4)，126.6(C-5)，125.8(C-6)，132.3(C-7)，115.2(C-8)，138.8(C-9)，171.2(C-11)，57.3(C-12)，34.9(C-13)，171.8(C-14)，70.9(C-15)，160.2(C-18)，121.9(C-19)，126.6(C-20)，128.1(C-21)，135.6(C-22)，127.9(C-23)，148.1(C-24)，148.1(C-26)，16.8(C-27)，23.2(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的基本一致，故鑒定化合物5為tryptoquivaline L。

化合物6：白色固體；EI-MS：m/z504[M]+；分子式C27H28N4O6。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：5.51(1H，s，H-2)，7.55(1H，d，J=7.3 Hz，H-5)，7.11(1H，t，J=7.6 Hz，H-6)，7.34(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.35(1H，d，J=7.4 Hz，H-8)，5.69(1H，d，J=7.0 Hz，H-12)，2.26(1H，dd，J=14.5，7.0 Hz，H-13a)，2.47(1H，dd，J=14.6，8.5 Hz，H-13b)，6.88(1H，s，OH-16)，8.33(1H，d，J=7.9 Hz，H-20)，7.55(1H，m，H-21)，7.8(1H，m，H-22)，7.69(1H，d，J=8.1 Hz，H-23)，5.51(1H，s，H-27)，2.75(1H，d，J=12.9 Hz，H-28)，1.10(3H，d，J=6.6 Hz，H-29)，1.15(3H，d，J=6.7 Hz，H-30)，1.60(3H，s，H-31)，1.48(3H，s，H-32)。13C NMR(125 MHz，DMSO)δ：86.1(C-2)，84.3(C-3)，135.3(C-4)，125.2(C-5)，127.3(C-6)，130.4(C-7)，115.9(C-8)，138.1(C-9)，169.3(C-11)，51.5(C-12)，35.9(C-13)，169.3(C-14)，75.0(C-15)，161.3(C-18)，120.2(C-19)，124.3(C-20)，127.7(C-21)，137.7(C-22)，127.3(C-23)，146.9(C-24)，149.2(C-26)，79.3(C-27)，35.6(C-28)，19.2(C-29)，19.9(C-30)，25.2(C-31)，26.0(C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的一個未命名的半合成化合物結(jié)構(gòu)一致，因此化合物6為新的天然產(chǎn)物，命名為quinadoline E。

化合物7：白色固體；EI-MS：m/z532[M]+；分子式：C28H28N4O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.19(1H，s，H-2)，7.41(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，7.22(1H，t，J=7.7 Hz，H-6)，7.45(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.60(1H，d，J=7.9 Hz，H-8)，5.69(1H，d，J=9.85 Hz，H-12)，3.20(1H，dd，J=13.8，10.6 Hz，H-13a)，3.02(1H，dd，J=13.8，9.3 Hz，H-13b)，4.36(1H，d，J=7.1 Hz，H-15)，7.29(1H，s，OH-16)，8.23(1H，d，J=7.9 Hz,H-20)，7.53(1H，t，J=7.3 Hz，H-21)，7.83(1H，dd，J=11.9，4.8 Hz，H-22)，7.77(1H，d，J=8.1 Hz，H-23)，5.57(1H，d，J=9.1 Hz，H-27)，2.65(1H，td，J=6.7，13.5 Hz，H-28)，1.02(3H，d，J=9.0 Hz，H-29)，1.18(3H，d，J=6.6 Hz，H-30)，2.17(3H，s，H-33)，1.60(3H，s，H-34)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ：90.3(C-2)，84.4(C-3)，133.9(C-4)，124.1(C-5)，125.8(C-6)，132.1(C-7)，116.2(C-8)，137.9(C-9)，169.4(C-11)，55.0(C-12)，33.7(C-13)，169.6(C-14)，78.2(C-15)，161.7(C-18)，120.3(C-19)，126.9(C-20)，128.3(C-21)，135.6(C-22)，128.0(C-23)，146.7(C-24)，152.7(C-26)，77.3(C-27)，32.0(C-28)，18.9(C-29)，18.8(C-30)，171.3(C-32)，20.9(C-33)，11.3(C-34)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物7為nortryptoquivaline。

化合物8：白色固體；EI-MS：m/z546[M]+；分子式：C29H30N4O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.00(1H，s，H-2)，7.40(1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，7.25(1H，m，H-6)，7.46(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.61(1H，d，J=7.9 Hz，H-8)，5.68(1H，d，J=9.85 Hz，H-12)，3.17(1H，dd，J=13.7，10.5 Hz，H-13a)，3.05(1H，dd，J=13.8，9.5 Hz，H-13b)，7.12(1H，s，OH-16)，8.22(1H，d，J=7.9 Hz，H-20)，7.54(1H，t，J=7.5 Hz，H-21)，7.83(1H，m，H-22)，7.77(1H，d，J=8.0 Hz，H-23)，5.59(1H，d，J=9.0 Hz，H-27)，2.64(1H，m,H-28)，1.03(3H，d，J=6.8 Hz，H-29)，1.17(3H，d，J=6.6 Hz，H-30)，2.17(3H，s，H-33)，1.48(3H，s，H-34)，1.50(3H，s，H-35)。13CNMR(125 MHz,CDCl3)δ：87.9(C-2)，84.4(C-3)，133.9(C-4)，124.1(C-5)，125.0(C-6)，132.0(C-7)，116.1(C-8)，138.1(C-9)，169.8(C-11)，55.0(C-12)，34.0(C-13)，171.1(C-14)，71.6(C-15)，161.6(C-18)，120.3(C-19)，126.9(C-20)，128.0(C-21)，135.6(C-22)，128.2(C-23)，146.7(C-24)，152.7(C-26)，77.3(C-27)，32.0(C-28)，19.0(C-29)，18.7(C-30)，171.2(C-32)，20.9(C-33)，17.2(C-34)，23.0(C-35)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的基本一致，故鑒定化合物8為tryptoquivaline。

化合物9：白色固體；EI-MS：m/z546[M]+；分子式：C29H30N4O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.01(1H，s，H-2)，7.80(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，7.26(1H，t，J=7.5 Hz，H-6)，7.47(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.59(1H，d，J=8.8 Hz，H-8)，5.86(1H，dd，J=18.4，8.9 Hz，H-12)，3.67(1H，dd，J=12.3，10.9 Hz，H-13a)，2.69(1H，dd，J=9.0，12.6 Hz，H-13b)，6.89(1H，s，OH-16)，8.29(1H，d，J=7.9 Hz，H-20)，7.54(1H，t，J=7.5 Hz，H-21)，7.80(1H，m，H-22)，7.75(1H，d，J=7.9 Hz，H-23)，5.56(1H，d，J=9.6 Hz，H-27)，2.63(1H，m,H-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-29)，1.01(3H，d，J=6.6 Hz，H-30)，2.11(3H，s，H-33)，1.27(3H，s，H-34)，1.43(3H，s，H-35)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ：88.2(C-2)，83.8(C-3)，132.2(C-4)，125.7(C-5)，126.2(C-6)，131.6(C-7)，115.7(C-8)，138.8(C-9)，171.0(C-11)，55.0(C-12)，35.1(C-13)，171.2(C-14)，71.7(C-15)，161.7(C-18)，120.9(C-19)，126.8(C-20)，128.1(C-21)，135.1(C-22)，127.9(C-23)，146.5(C-24)，152.3(C-26)，78.4(C-27)，31.5(C-28)，18.6(C-29)，19.0(C-30)，171.4(C-32)，20.8(C-33)，17.0(C-34)，22.6(C-35)。以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物9為27-epi-trypto‐quivalin。

化合物10：白色固體；EI-MS：m/z342[M]+；分子式為C20H14N4O2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：5.66(1H，m，H-2)，7.82(1H，m，H-6)，7.54(1H，mt，H-7)，8.15(1H，dd，J=8.0，1.3 Hz，H-8)，5.32(1H，d，J=5.4 Hz，H-11)，3.46(1H，dd，J=17.3，2.7 Hz，H-12a)，3.26(1H，dd，J=17.4，4.4 Hz，H-12b)，7.38(1H，d，J=8.2 Hz，H-16)，7.11(1H，t，J=7.5 Hz，H-17)，6.99(1H，t，J=7.4 Hz，H-18)，7.42(1H，d，J=7.9 Hz，H-19)。13CNMR(125 MHz,DMSO)δ：169.3(C-1)，54.4(C-2)，152.2(C-3)，146.9(C-4)，134.8(C-6)，127.2(C-7)，126.4(C-8)，120.3(C-9)，159.2(C-10)，51.1(C-11)，25.5(C-12)，105.0(C-13)，131.5(C-14)，134.8(C-15)，111.6(C-16)，122.2(C-17)，119.3(C-18)，118.2(C-19)，127.2(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的基本一致，故鑒定化合物10為prelapatin B。

化合物11：白色固體；EI-MSm/z344[M]+；分子式C20H16N4O2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：3.07(1H，d，J=17.0 Hz，H-2a)，3.80(1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-2b)，7.55(1H，t，J=8.4 Hz,H-5)，7.83(1H，m，H-6)，7.55(1H，t，J=8.4 Hz，H-7)，8.21(1H，d，J=8.1 Hz，H-8)，5.27(1H，d，J=4.9 Hz，H-11)，3.43(2H，dd，J=10.2，6.9 Hz，H-12)，6.86(1H，d，J=2.2 Hz，H-14)，7.26(1H，t，J=7.9 Hz，H-16)，6.77(1H，t，J=7.5 Hz，H-17)，7.00(1H，t，J=7.5 Hz，H-18)，7.31(1H，d，J=8.1 Hz，H-19)。13C NMR(125 MHz,DMSO)δ：160.0(C-1)，43.8(C-2)，149.3(C-3)，147.0(C-4)，126.3(C-5)，134.7(C-6)，126.6(C-7)，126.7(C-8)，119.9(C-9)，167.6(C-10)，56.5(C-11)，26.5(C-12)，107.8(C-13)，124.4(C-14)，136.0(C-15)，117.8(C-16)，118.6(C-17)，121.2(C-18)，111.4(C-19)，127.2(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的基本一致，故鑒定化合物11為glyantrypine。

3.2 化合物的NO抑制活性研究

以吲哚美辛為陽性對照，分別考察了化合物1～10對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO的抑制作用，結(jié)果表明化合物2、6、7、10具有中等抑制作用，IC50分別為（30.2±0.4）μmol/L、（41.2±0.6）μmol/L、（53.7±0.4）μmol/L和（36.9±0.3）μmol/L，其他化合物活性弱或無活性，見表1。同時，采用MTT法考察了化合物對RAW 264.7細胞的毒性作用，結(jié)果顯示化合物在大于50μmol/L的測試濃度下均未表現(xiàn)出細胞毒作用。

表1 化合物對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of some compounds against LPSinduced NO production in RAW 264.7 cells(n=3,x±s)

4 結(jié)論

本研究從一株無瓣海桑內(nèi)生曲霉屬真菌的大米培養(yǎng)基中分離得到11個吲哚生物堿類化合物，根據(jù)理化數(shù)據(jù)和波譜數(shù)據(jù)分別鑒定了其結(jié)構(gòu)，其中化合物2和6為新發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物。以上生物堿具有獨特的結(jié)構(gòu)特征，分別屬于異戊二烯基吲哚衍生物、喹唑啉吲哚衍生物和吡嗪喹唑啉吲哚衍生物。此類生物堿通常從曲霉屬真菌[16,21]的代謝產(chǎn)物中分離出來，少數(shù)從嗜麥芽窄食單胞菌[15]、新薩托菌[18]、子囊菌[19]、枝孢菌[20]的代謝產(chǎn)物中得到。已報道的生物活性包括致顫性[19]、抗菌[22]、抗腫瘤[23]等，未見抗炎活性的報道。本文考察了化合物1～10對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO的抑制作用，顯示化合物2、6、7、10具有較好的體外抗炎活性；構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)部分化合物結(jié)構(gòu)極為相似，活性卻差別明顯，如化合物1～4結(jié)構(gòu)差別很小，而只有化合物2顯示出較強的抗炎活性；化合物5～9結(jié)構(gòu)類似而活性不同，說明某個取代基的不同與吲哚類生物堿抗炎活性有明顯的相關(guān)性。本文研究結(jié)果對于研究結(jié)構(gòu)與抗炎活性之間的構(gòu)效關(guān)系具有一定的參考意義，為進一步的結(jié)構(gòu)修飾和藥理學(xué)研究提供了線索。