自噬在吉西他濱抑制巨噬細(xì)胞免疫中的作用及機(jī)制研究

潘姝，姜珊珊，原永芳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

吉西他濱(gemcitabine,Gem)是胰腺癌的一線用藥[1]。除了細(xì)胞毒性，吉西他濱還具有免疫調(diào)節(jié)作用。如吉西他濱可選擇性作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等[2]。然而，吉西他濱對巨噬細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。

基于巨噬細(xì)胞的免疫療法相比放療、化療及手術(shù)療法具有更好的療效及耐受性[3]。巨噬細(xì)胞約占實(shí)體瘤免疫細(xì)胞總量的5%～40%，是種類最豐富的免疫細(xì)胞[4]。研究表明，M1型巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要的作用[5]。巨噬細(xì)胞通過內(nèi)吞、分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6、IL-1及產(chǎn)生NO及活性氧來發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究擬探討吉西他濱對M1型巨噬細(xì)胞功能的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%（φ）FBS及1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞放置于含5%（φ）CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.2 材料與試劑 鹽酸吉西他濱購自上海源葉生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒及Griess試劑購自碧云天生物科技研究所；IFN-γ購自塞業(yè)生物科技有限公司；LPS購自Sigma-Aldrich公司；TNF-α和IL-6檢測試劑盒購自上海船夫生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒購自凱基生物技術(shù)股份有限公司；FcRγ組織劑（FCGR2/CD32和FCGR/CD16）和PE-conjugated I-A/I-E抗體購自BD公司；LC3-Ⅱ和β-actin購自Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自上海明睿生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn) 將巨噬細(xì)胞Ana-1培養(yǎng)在共聚焦皿里，300 IU/mL的IFN-γ和100 ng/mL的LPS及100 ng/mL吉西他濱在37℃環(huán)境下共同處理24 h。100 mg/L酵母聚糖孵育2 h，激光共聚焦下觀察巨噬細(xì)胞的吞噬情況。

1.2.2 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗2次，70%（φ）乙醇4℃下固定過夜，PBS洗2次，根據(jù)試劑盒說明書加入PI染色液，37℃避光孵育20 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.2.3 透射電子顯微鏡分析 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103/孔的密度種于6孔板中，用適當(dāng)濃度藥物處理一定時(shí)間，收集細(xì)胞，用含2%戊二醛的培養(yǎng)基固定15 min，1 500 r/min離心，棄去培養(yǎng)基，小心加入1 mL固定液固定過夜，0.1 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，用乙醇梯度脫水，60℃放置48 h，在透射電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察 Ana-1細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度種于6孔板中，經(jīng)藥物處理后，無血清培養(yǎng)基洗2遍后用染料Hoechst 33342（藍(lán)色熒光），自噬檢測試劑Cyto-ID?（綠色熒光）及ROS檢測試劑Mito Sox（紅色熒光）避光孵育15 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞上清液NO水平檢測 將巨噬細(xì)胞Ana-1接種于96孔板中，藥物處理后，根據(jù)NO檢測試劑盒說明書，用培養(yǎng)基將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一定的濃度梯度（0、1、5、10、20、40、60、100μmol/L），在96孔板中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品及細(xì)胞上清液，再加入50μL Griess Reagent I和50μL Griess ReagentⅡ，酶標(biāo)儀在540 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.2.6 ROS表達(dá)水平檢測 將巨噬細(xì)胞Ana-1接種至黑色96孔培養(yǎng)板中，藥物處理后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入50μL的10μmol/L DCFH-DA，37℃細(xì)胞孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀檢測吸光度值。

1.2.7 Elisa檢測上清液免疫因子表達(dá)水平 將巨噬細(xì)胞Ana-1接種至24孔板中，藥物處理后，吸取100μL細(xì)胞上清液或標(biāo)準(zhǔn)品加入Elisa反應(yīng)板中，標(biāo)準(zhǔn)品按照以下濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 pg/mL）。每孔加入50μL生物素化抗體工作液，封板條封住反應(yīng)孔，孵育120 min，洗滌4次，除空白孔外，每孔加入100μL顯色液，黑暗條件下孵育20 min，隨后加入100μL終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值。

1.2.8 MHC-Ⅱ表達(dá)水平檢測 巨噬細(xì)胞Ana-1經(jīng)藥物處理后用200μL培養(yǎng)基重懸，加入4μL FcRγ阻滯劑（FCGR2/CD32和FCGR3/CD16），37℃孵育5 min，隨后加入4μL PE-conjugated I-A/I-E抗體，37℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測MHC-Ⅱ表達(dá)水平。

1.2.9 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將對數(shù)期細(xì)胞以5×103/孔的密度種于6孔板中，藥物作用特定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，用RIPA裂解液重懸并裂解細(xì)胞，冰上放置30 min待細(xì)胞充分裂解，4℃下12 000 r/min離心5 min收集上清液。每孔上樣等量蛋白并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜并用含5%牛血清蛋白的TBST進(jìn)行封閉1.5 h，一抗孵育過夜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次后ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行顯色，觀察凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉西他濱對巨噬細(xì)胞功能的影響

Ana-1小鼠巨噬細(xì)胞被IFN-γ/LPS誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞[7]，觀察吉西他濱對M1型巨噬細(xì)胞周期及吞噬作用的影響。如圖1A～圖1B所示，與對照組相比，吉西他濱能夠抑制M1型巨噬細(xì)胞周期S期阻滯。激光共聚焦顯微鏡觀察吉西他濱對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。如圖1C所示，IFN-γ/LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬作用，聯(lián)合吉西他濱后，吞噬作用被抑制。結(jié)果表明吉西他濱能夠抑制M1型巨噬細(xì)胞的功能。

圖1 吉西他濱抑制Ana-1細(xì)胞周期和吞噬Figure 1 Gemcitabine inhibits cell cycle and phagocytosis of ANA-1 cells

2.2 吉西他濱對Ana-1細(xì)胞自由基的作用

Ana-1細(xì)胞中的DNA用Hoechst33324（藍(lán)色熒光）標(biāo)記，ROS用Mito Sox（紅色熒光標(biāo)記）。結(jié)果如圖2A所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞紅色熒光明顯增強(qiáng)，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細(xì)胞，紅色熒光明顯減弱。隨后，DCFH-DA標(biāo)記ROS，熒光酶標(biāo)儀下檢測ROS熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖2B所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱后，Ana-1細(xì)胞的ROS水平顯著降低（P<0.05）。隨后，檢測吉西他濱對Ana-1細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響。結(jié)果如圖2C所示，IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的NO水平約為對照組的2.5倍，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO水平約為對照組的1.5倍。表明吉西他濱能抑制活化的局勢細(xì)胞產(chǎn)生NO（P<0.01）。

ELISA檢測TNF-α和IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖2D～圖2E所示，IFN-γ和LPS誘導(dǎo)Ana-1產(chǎn)生TNF-α和IL-6分別為對照組的3.5和5.2倍。而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱，Ana-1產(chǎn)生TNF-α和IL-6分別為對照組的2和2.6倍，說明吉西他濱能夠抑制活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6。

MHC-Ⅱ參與特異性免疫應(yīng)答，接下來研究了吉西他濱對巨噬細(xì)胞抗原提呈能力的影響。結(jié)果如圖2F所示，IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的Ana-1細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)水平最高，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱抑制了MHC-Ⅱ的表達(dá)。結(jié)果表明吉西他濱能夠抑制巨噬細(xì)胞抗原提呈能力。

圖2 吉西他濱抑制Ana-1細(xì)胞自由基的產(chǎn)生Figure 2 Gemcitabine inhibits free radical production in ANA-1 cells

2.3 吉西他濱對Ana-1巨噬細(xì)胞自噬的影響

通過共聚焦顯微鏡和投射電鏡觀察巨噬細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生。使用Hoechst 33342（藍(lán)色熒光）標(biāo)記活細(xì)胞核，Cyto ID（綠色熒光）標(biāo)記自噬相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖3A所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的綠色熒光顯著增強(qiáng)，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細(xì)胞綠色熒光顯著減弱。投射電鏡下能夠明顯觀察到IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞有較多的自噬體結(jié)構(gòu)，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細(xì)胞自噬體結(jié)構(gòu)明顯減少（圖3B）。最后，用Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3C所示，IFN-γ和LPS聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，而IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)水平下降。表明，吉西他濱能夠抑制活化的巨噬細(xì)胞自噬。

圖3 吉西他濱抑制巨噬細(xì)胞自噬Figure 3 Gemcitabine inhibits autophagy in ANA-1 cells

2.4 激活A(yù)na-1細(xì)胞自噬逆轉(zhuǎn)吉西他濱免疫抑制

分別用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑海藻糖（Tre）分別處理活化的巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果如圖4A所示，激活細(xì)胞自噬，逆轉(zhuǎn)了吉西他濱對活化的巨噬細(xì)胞抑制。而抑制自噬，巨噬細(xì)胞的吞噬功能仍處于較低水平。考察巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B～圖4D所示，與IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理的巨噬細(xì)胞相比，激活細(xì)胞自噬后，IFN-γ和LPS聯(lián)合吉西他濱處理組的TNF-α、IL-6和MHC-Ⅱ表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明，激活巨噬細(xì)胞自噬，能夠逆轉(zhuǎn)吉西他濱對活化的巨噬細(xì)胞的免疫抑制。

圖4 激活抑制巨噬細(xì)胞自噬逆轉(zhuǎn)免疫抑制Figure 4 Activation of autophagy reverses immune inhibition in Ana-1 cells

3 討論

吉西他濱是一種嘧啶類抗腫瘤藥物，用于多種實(shí)體瘤的化學(xué)療法，如胰腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌[8]。然而，吉西他濱的藥物抵抗始終是影響治療成功與否的阻礙。研究表明，一個(gè)有效的免疫體系對化療藥物的抗腫瘤療效具有促進(jìn)作用，而在腫瘤微環(huán)境中，抑制免疫可以促進(jìn)藥物抵抗[9]。

在腫瘤微環(huán)境中，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均可啟動或抑制對腫瘤細(xì)胞的免疫進(jìn)攻[10]?；瘜W(xué)療法所產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)和免疫抑制作用依賴于藥物種類、劑量、服藥時(shí)間和腫瘤類型等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫。而另有研究，吉西他濱可通過激活髓性來源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的炎性通路而選擇性的降低抗腫瘤效果[12]；Sachin等[13]發(fā)現(xiàn)吉西他濱作用于胰腺癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7遷徙、侵襲和增長，同時(shí)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展。

吉西他濱對M1型巨噬細(xì)胞的功能及作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究聯(lián)合IFN-γ和LPS將Ana-1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化為M1型巨噬細(xì)胞，考察吉西他濱對其功能的影響。利用巨噬細(xì)胞對異物具有很強(qiáng)的吞噬功能的原理，觀察巨噬細(xì)胞對熒光納米粒的吞噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能夠抑制M1巨噬細(xì)胞吞噬功能。炎癥狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生自由基ROS和NO，幫助機(jī)體清除病原微生物和腫瘤細(xì)胞。吉西他濱顯著降低了M1巨噬細(xì)胞ROS和NO表達(dá)水平?；罨木奘杉?xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)會上調(diào)，同時(shí)釋放多種細(xì)胞因子，如IL-6和TNF-α。IL-6可參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，而TNF-α參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。流式細(xì)胞術(shù)和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吉西他濱抑制了M1巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的釋放并降低了MHC-Ⅱ的表達(dá)。以上結(jié)果表明吉西他濱能夠抑制M1巨噬細(xì)胞功能。

自噬在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫中發(fā)揮了重要作用[14]。本研究考察了吉西他濱對巨噬細(xì)胞自噬的影響。發(fā)現(xiàn)IFN-γ和LPS激活的M1巨噬細(xì)胞自噬體及相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)顯著升高，而聯(lián)合吉西他濱處理組的M1巨噬細(xì)胞自噬體顯著降低。說明吉西他濱能夠抑制M1巨噬細(xì)胞自噬。為了研究自噬在巨噬細(xì)胞功能中的作用，分別用自噬誘導(dǎo)劑海藻糖（Tre）和自噬抑制劑3-MA激活和抑制細(xì)胞自噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑可逆轉(zhuǎn)吉西他濱對M1巨噬細(xì)胞的免疫抑制。表現(xiàn)為吞噬功能增強(qiáng)，細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及MHC-Ⅱ表達(dá)增加。

本研究發(fā)現(xiàn)吉西他濱能抑制M1型巨噬細(xì)胞免疫功能，同時(shí)吉西他濱能夠抑制巨噬細(xì)胞自噬。激活自噬，能逆轉(zhuǎn)吉西他濱對M1型巨噬細(xì)胞的免疫抑制。本研究為吉西他濱在臨床的應(yīng)用提供了新的思路。