不同濃度七氟醚預(yù)處理對tGCI大鼠模型海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的影響

汪 靜 李文謙 曾慶繁

1）貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001 2）貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

短暫性全腦缺血（transient global cerebral ischemia，tGCI）是一種起病突兀的神經(jīng)內(nèi)科疾?。?］，好發(fā)于中老年男性人群，且多在患者運(yùn)動過量、突然起立、轉(zhuǎn)頸等時候發(fā)病。發(fā)病時長為5～20 min，可反復(fù)發(fā)展，通常24 h后可自我恢復(fù)，且無明顯后遺癥［2］。臨床尚未就tGCI 病機(jī)達(dá)成統(tǒng)一結(jié)論，但分析可能與以下幾點有關(guān)：（1）腦動脈粥樣硬化：腦動脈粥樣硬化通過引發(fā)腦動脈狹窄影響腦部供血，如硬化斑塊破裂，這些破裂物質(zhì)將可能栓塞血管，導(dǎo)致小動脈梗阻，最終引發(fā)tGCI；（2）微栓塞：斑塊破裂的微小凝塊并無法直接栓塞血管，但這些凝塊將與血小板等物質(zhì)結(jié)合并生成微栓子，當(dāng)微栓子進(jìn)入微小動脈后，將引發(fā)局部缺血現(xiàn)象，即tGCI；（3）心臟疾病：心房纖維顫動、左心肥厚以及心功能不全等均可能通過影響血流動力指標(biāo)或介導(dǎo)栓子脫落參與tGCI；（4）血流動力學(xué)變化：快速起立或快速扭頭轉(zhuǎn)頸均可能導(dǎo)致腦血流變化，并引發(fā)tGCI，如患者已存在動脈粥樣硬化、頸動脈竇過敏，其tGCI發(fā)病率還將進(jìn)一步提高［3］；（5）血液成分變化：貧血、白細(xì)胞、血小板增多癥等影響人體血液成分，導(dǎo)致血氧、血脂、血蛋白異常變化，影響人體血液黏度，導(dǎo)致血液出現(xiàn)病理狀態(tài)，最終參與tGCI 的發(fā)生、發(fā)展。患者臨床癥狀與其缺血的動脈系統(tǒng)有關(guān)，頸內(nèi)動脈缺血患者癥狀以偏癱、失語、單向眼視力障礙為主；椎基底動脈缺血患者癥狀則以眩暈、站立不穩(wěn)、一過性視力缺失、輕度偏癱等為主［4］。盡早恢復(fù)tGCI患者血供是本病的主要急救辦法，但也帶來新的問題，即腦缺血再灌注損傷［5］。既往研究顯示，預(yù)處理可有效提升tGCI 患者缺血耐受性，并保護(hù)患者神經(jīng)［6-7］。七氟醚是一種具有缺陷耐受誘導(dǎo)功能的麻醉藥物，研究顯示［8］，七氟醚預(yù)處理可對tGCI 造模大鼠腦神經(jīng)形成保護(hù)效應(yīng)，但其最佳作用濃度及可能的作用機(jī)制臨床尚無結(jié)論。為分析tGCI 的最佳作用濃度，本文選取48 只SD 大鼠進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組選取成年健康WKY 大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量240～250 g，購自于貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，質(zhì)量合格證號：SYXK（黔）2018-0001；將SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由攝食飲水，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對濕度65%～75%。將所有WKY 大鼠隨機(jī)分為模型組、2%七氟醚預(yù)處理組、4%七氟醚預(yù)處理組和6%七氟醚預(yù)處理組，每組12只。

1.2實驗方法

1.2.1 造模及處理方法：對大鼠進(jìn)行水合氯醛麻醉后，于頸部設(shè)置1 cm 切口，顯露頸側(cè)總動脈，選用硅膠管包繞總動脈，并固定于硬塑圓筒上，縫合切口后，將大鼠固定在定位儀上，同時對其進(jìn)行枕部行縱向1 cm切口，顯露第一頸椎及橫突板，電凝栓塞橫突板翼小孔椎動脈后縫合切口。將大鼠送回籠中，正常喂養(yǎng)24 h 后進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理10 min 后夾閉頸總動脈，大鼠30～60 s內(nèi)昏迷即表明造模成功，10 min后恢復(fù)大鼠頸總動脈供血［9］。

預(yù)處理前對大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，根據(jù)分組情況進(jìn)行生理鹽水，2%、4%及6%七氟醚預(yù)處理，操作具體如下：將大鼠置于麻醉箱內(nèi)，將生理鹽水或?qū)?yīng)濃度的七氟醚與100%氧氣進(jìn)行混合，并讓大鼠呼吸1 h。

1.2.2 HE染色：斷頭處死大鼠，取出海馬組織，將其固定后選用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗，并置于2%明膠內(nèi)，取出后烘干并選用乙醇脫水，將樣本置于0.06%高錳酸鉀溶液內(nèi)反應(yīng)8 min，取出后沖洗，選用蘇木素進(jìn)行染色，伊紅復(fù)染，乙醇脫水后封片，顯微鏡讀取結(jié)果。

1.2.3 神經(jīng)元活力測定：選用四唑鹽比色法鑒定大鼠神經(jīng)元存活情況，取2 g 海馬組織，搗碎制備為懸液，滴至48孔板內(nèi)，同時每孔滴入10 μL 5 mg/mL四唑鹽磷酸緩沖液，培養(yǎng)箱孵化6 h后，丟棄上清液，每孔滴入80 μL DMSO溶液的深藍(lán)色結(jié)晶，混勻后反應(yīng)15 min，通過酶標(biāo)儀檢測OD值。

1.2.4 神經(jīng)元凋亡率測定：將海馬細(xì)胞懸液置于試管內(nèi)，滴入0.125%胰蛋白酶進(jìn)行消化，反應(yīng)5 min，1 500 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，棄上清，滴入0.1 mol PBS，同前參數(shù)再次離心，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/mL，滴入10 μL Annexin V-FITC，混勻后反應(yīng)10 min，滴入5 μL PI，混勻后反應(yīng)15 min，加入350 μL Annexin V Binding solution溶液，反應(yīng)60 min后通過流式細(xì)胞儀讀取結(jié)果。

1.2.5 Western blot 檢測：選用0.125%胰蛋白酶對海馬細(xì)胞懸液進(jìn)行消化，反應(yīng)5 min 后，1 500 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，滴入3 μL 細(xì)胞裂解液，于4 ℃溫度下反應(yīng)20 min，隨后進(jìn)行2 000 r/min、5 cm 半徑離心，時間8 min，提取總蛋白，并通過BCA法分析總蛋白濃度。將總蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后選用Bax、LC3-Ⅱ、Bcl-2 一抗，靜置過夜，次日取出后洗滌2 次，滴入IgG 抗體進(jìn)行二抗，室溫下靜置反應(yīng)60 min，洗滌2次，滴入化學(xué)發(fā)光試劑，震蕩均勻反應(yīng)60 s后，通過凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較使用F 檢驗。檢驗水準(zhǔn)取a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬組織HE染色模型組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及排列紊亂，細(xì)胞水腫，成片神經(jīng)元系統(tǒng)核皺縮，七氟醚預(yù)處理組海馬結(jié)構(gòu)異常情況較模型組改善，其中6%七氟醚預(yù)處理組海馬結(jié)構(gòu)較清晰，排列有序，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較正常。見圖1。

圖1 各組海馬組織HE染色（×400，A：模型組；B：2%七氟醚預(yù)處理組；C：4%七氟醚預(yù)處理組；D：6%七氟醚預(yù)處理組）Figure 1 HE staining of hippocampus in each group（×400，A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group）

2.2 各組海馬組織神經(jīng)元活力OD值比較七氟醚預(yù)處理組海馬組織神經(jīng)元活力OD 值明顯高于模型組（P＜0.05），其中6%七氟醚預(yù)處理組海馬神經(jīng)元活力OD 值高于2%七氟醚預(yù)處理組和4%七氟醚預(yù)處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組海馬組織神經(jīng)元活力OD值比較 （±s）Table 1 Comparison of OD values of hippocampal neurons in each group （±s)

表1 各組海馬組織神經(jīng)元活力OD值比較 （±s）Table 1 Comparison of OD values of hippocampal neurons in each group （±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預(yù)處理組4%七氟醚預(yù)處理組6%七氟醚預(yù)處理組n F值P值12 12 12 12 OD組0.73±0.12 1.12±0.24a 1.30±0.27ab 1.55±0.26abc 24.031 0.000

2.3 各組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較七氟醚預(yù)處理組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05），其中6%七氟醚預(yù)處理組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于2%七氟醚預(yù)處理組和4%七氟醚預(yù)處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性。見表2、圖2。

表2 各組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 （±s）Table 2 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons in each group （±s）

表2 各組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 （±s）Table 2 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons in each group （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預(yù)處理組4%七氟醚預(yù)處理組6%七氟醚預(yù)處理組n F值P值12 12 12 12細(xì)胞凋亡率（%）45.51±7.36 32.21±8.11a 23.05±6.88ab 12.24±3.11abc 65.546 0.000

圖2 各組海馬海馬組織神經(jīng)細(xì)胞流式細(xì)胞檢測圖（A：模型組；B：2%七氟醚預(yù)處理組；C：4%七氟醚預(yù)處理組；D：6%七氟醚預(yù)處理組）Figure 2 Flow cytometry of hippocampal neurons in each group(A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group)

2.4 各組海馬組織蛋白表達(dá)比較七氟醚預(yù)處理組海馬組織Bax 蛋白相對表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0.05），而Bcl-2、LC3-Ⅱ相對表達(dá)量明顯高于模型組（P＜0.05）；其中6%七氟醚預(yù)處理組海馬組織Bax蛋白相對表達(dá)量低于2%七氟醚預(yù)處理組和4%七氟醚預(yù)處理組（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于2%七氟醚預(yù)處理組和4%七氟醚預(yù)處理組（P＜0.05），呈劑量依賴性；6%七氟醚預(yù)處理組海馬組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量與2%七氟醚預(yù)處理組和4%七氟醚預(yù)處理組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 Western blot檢查圖（A：模型組；B：2%七氟醚預(yù)處理組；C：4%七氟醚預(yù)處理組；D：6%七氟醚預(yù)處理組）Figure 3 Western blot(A：model group；B：2% sevoflurane pretreatment group；C：4% sevoflurane pretreatment group；D：6% sevoflurane pretreatment group)

表3 各組海馬組織蛋白比較 （±s）Table 3 Comparison of protein in hippocampus of each group （±s）

表3 各組海馬組織蛋白比較 （±s）Table 3 Comparison of protein in hippocampus of each group （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，bP＜0.05；與2%七氟醚預(yù)處理組比較，cP＜0.05

組別模型組2%七氟醚預(yù)處理組4%七氟醚預(yù)處理組6%七氟醚預(yù)處理組F值P值Bcl-2相對表達(dá)量0.401±0.101 0.483±0.105a 0.514±0.100ab 0.980±0.112abc 16.654 0.000 n 12 12 12 12 Bax蛋白相對表達(dá)量0.902±0.114 0.564±0.103a 0.311±0.097ab 0.122±0.081abc 20.124 0.000 LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量0.675±0.103 0.911±0.101a 0.903±0.104a 0.901±0.108a 18.877 0.000

3 討論

海馬是多種生物的腦植物性神經(jīng)功能及高級神經(jīng)活動的載體，對缺血/缺氧具有較高靈敏度，是缺氧-復(fù)氧神經(jīng)損傷研究工作的理想模型［10-11］。本研究中tGCI 造模后大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及排列紊亂，細(xì)胞水腫，成片神經(jīng)元系統(tǒng)核出現(xiàn)皺縮。七氟醚則是一種麻醉誘導(dǎo)及蘇醒均快速平穩(wěn)的吸入性麻醉藥物，既往研究顯示，預(yù)先七氟醚吸入可對大鼠腦缺血損傷形成保護(hù)效應(yīng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠七氟醚預(yù)處理后，其海馬結(jié)構(gòu)有所改善，且6%濃度七氟醚預(yù)處理組大鼠改善情況最佳，可以發(fā)現(xiàn)七氟醚預(yù)處理在降低大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞上具有顯著價值，其療效與藥物濃度有關(guān)。分析其可能作用機(jī)制：七氟醚可有效降低大鼠腦代謝水平，同時抑制氧自由基表達(dá)，形成抗氧化效應(yīng)［13］。七氟醚還可阻滯N-甲基-D-天冬氨酸受體劑谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元去極化，抑制鈣質(zhì)內(nèi)流，進(jìn)而阻滯其引發(fā)的神經(jīng)元凋亡反應(yīng)［14-15］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理組海馬組織神經(jīng)元活力OD 值明顯高于模型組，且6%七氟醚預(yù)處理組海馬神經(jīng)元活力OD值最高，同時七氟醚預(yù)處理組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，而6%七氟醚預(yù)處理組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率最低，表明6%七氟醚預(yù)處理可最大程度降低大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率，維持其活性。研究發(fā)現(xiàn)，開放線粒體膜內(nèi)的mitoKATP路徑活化是吸入麻醉藥劑預(yù)處理措施生成心、腦保護(hù)效應(yīng)的重要機(jī)制［16］。七氟醚可通過活化mitoKATP 路徑影響B(tài)cl-2、Bax 蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡［17-18］。Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控介質(zhì)的一種，具有抗凋亡效應(yīng)，Bax 則具有促凋亡效應(yīng)，Bcl-2/Bax 比值直接決定了細(xì)胞的命運(yùn)。當(dāng)Bcl-2/Bax 比值下降，線粒體PT 路徑將被活化，大量的CytC將被釋放至細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，最終促使細(xì)胞凋亡；Bcl-2/Bax比值上升時，細(xì)胞凋亡率將大幅降低［19-20］。本研究中七氟醚預(yù)處理組海馬組織Bax 蛋白相對表達(dá)量明顯低于模型組，而Bcl-2相對表達(dá)量明顯高于模型組，表明七氟醚預(yù)處理可通過影響B(tài)ax、Bcl-2表達(dá)水平影響大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧-復(fù)氧造模大鼠七氟醚預(yù)處理后，其Bcl-2/Bax比值顯著提高，大鼠腦神經(jīng)元凋亡率也隨之降低，大鼠出現(xiàn)缺血性腦損傷耐受［21］，與本研究結(jié)果相似。

自噬特指細(xì)胞對自身成分的消化過程，在細(xì)胞營養(yǎng)匱乏、血氧供給不足或出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)時，其自噬率將大幅增高［22］。LC3-Ⅱ是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白之一，其主要表達(dá)于自噬體膜上，因此LC3-Ⅱ蛋白的高表達(dá)往往意味著細(xì)胞自噬量大幅增高［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理組海馬組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量明顯低于模型組，表明七氟醚預(yù)處理可通過調(diào)控LC3-Ⅱ表達(dá)水平來干預(yù)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬，進(jìn)而阻止其凋亡。研究表明，七氟醚預(yù)處理后大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著改善，同時其LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平上升［24-30］。該學(xué)者認(rèn)為，七氟醚預(yù)處理后可預(yù)先啟動海馬神經(jīng)元自噬，進(jìn)而降低缺氧后的自噬率，增強(qiáng)海馬神經(jīng)元對缺氧的耐受，最終降低其凋亡率。

七氟醚預(yù)處理對tGCI大鼠模型后海馬組織神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，呈劑量依賴性，6%濃度或可能是其最佳藥效濃度，而七氟醚預(yù)處理的大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)控Bax、LC3-Ⅱ和Bcl-2 表達(dá)有關(guān)。