絕經(jīng)后婦女不同中醫(yī)證型膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨ERRα/SOX9信號通路 表達分析

李朋 李釗 羅天 胡仕暢 霍少川

摘要 目的：探討ERRα/SOX9信號通路在絕經(jīng)后婦女不同證型膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）關(guān)節(jié)軟骨中的作用。方法：選取2018年6月至2019年4月廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院收治的絕經(jīng)后KOA患者，根據(jù)中醫(yī)證型標準分為風寒濕痹證、風濕熱痹證、瘀血閉阻證和肝腎虧虛證4組，采用RT-PCR和Western Blot檢測ERRα/SOX9信號通路表達情況。結(jié)果：各組間膝關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα、SOX9和Col2α1表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與風寒濕痹組比較，風濕熱痹組ERRα、SOX9和Col2α1表達量之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;瘀血痹阻組ERRα表達量升高，SOX9、Col2α1表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1表達量降低（P<0.05），SOX9表達量升高（P<0.05）。與風濕熱痹組比較，瘀血痹阻組ERRα表達量升高，SOX9、Col2α1表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1表達量降低（P<0.05），SOX9表達量升高（P<0.05）。與瘀血痹阻組比較，肝腎虧虛組ERRα、Col2α1表達量降低（P<0.05）;SOX9表達量升高（P<0.05）。結(jié)論：絕經(jīng)后婦女不同中醫(yī)證型KOA患者關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα/SOX9信號通路存在差異，揭示不同證型ERRα/SOX9信號通路的差異將為中醫(yī)藥辨證施治絕經(jīng)后KOA提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 膝骨關(guān)節(jié)炎;ERRα/SOX9信號通路;絕經(jīng)后婦女;關(guān)節(jié)軟骨;中醫(yī)辨證分型;

Analysis of ERR a /SOX9 Signaling Pathway in Articular Cartilage of Postmenopausal

with Different Traditional Chinese Medicine Syndromes of Knee Osteoarthritis

LI Peng1，LI Zhao1，LUO Tian1，HU Shichang2，HUO Shaochuan3

（1 Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510240，China;

2 Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510450，China; 3 The First Affiliated

Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To investigate the role of ERRa /SOX9 signaling pathway in postmenopausal women with different types of knee osteoarthritis articular cartilage.Methods：Postmenopausal KOA patients admitted to Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine were selected as the research objects and were divided into 4 groups according to TCM syndrome type criteria：wind-cold-dampness arthralgia syndrome，wind-dampness-heat arthralgia，blood stasis arthralgia syndrome，and liver-kidney deficiency syndrome.Rt-pcr and Western Blot were used to detect the ERR alpha /SOX9 signal pathway expression.Results：The difference of ERR-alpha，SOX9 and Col2-alpha-1 expression was statistically significant（P<0.05）.Compared with wind-cold-dampness arthralgia group，there was no statistically significant difference in the expression of ERRα，SOX9 and Col2α1 in wind-dampness-heat arthralgia groups（P<0.05）.Compared with the blood stasis arthralgia瘀血痹阻 group，there was no significant difference in the expression of ERRα，SOX9 and Col2α1 in the wind-dampness-heat arthralgia group（P>0.05）; the expression of ERRα increased in the blood stasis arthralgia group，and the expression of SOX9 and Col2α1 decreased（P<0.05）; the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05），and the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Compared with the wind-dampness-heat arthralgia，the expression of ERRα in the blood stasis arthralgia increased，and the expression of SOX9 and Col2α1 decreased（P<0.05）; the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05），and the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Compared with blood stasis arthralgia group，the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05）; the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Conclusion：There are differences in the ERR alpha /SOX9 signaling pathways in the articular cartilage of postmenopausal women with different TCM syndromes of KOA.The discovery of the differences in the ERR alpha /SOX9 signaling pathways between different syndroms of KOA provides a theoretical basis for TCM syndrome differentiation in the treatment of post-menopausal KOA.

Keywords Knee Osteoarthritis; ERR a /SOX9 signaling pathway; Postmenopausal; Articular cartilage; TCM syndrome differentiation

中圖分類號：R271.9;R274.9;R274.32文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.027

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、活動受限甚至關(guān)節(jié)畸形為主要臨床癥狀，是以膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨下骨外露、關(guān)節(jié)骨贅生成、關(guān)節(jié)間隙變窄等為病理改變的膝關(guān)節(jié)退行性疾患，也是中老年人的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率隨年齡增長逐漸升高，在中國，從40歲開始發(fā)病率逐漸升高，60～70歲達到高峰，65歲及以上的老年人發(fā)病率高達75%[1-2]。其主要表現(xiàn)為雙側(cè)膝關(guān)節(jié)疼痛和僵硬、關(guān)節(jié)腫脹和變形、股四頭肌無力和消瘦等癥狀和體征，嚴重影響患者生活和工作[3]。KOA屬中醫(yī)“痹證”范疇，依據(jù)“國家中醫(yī)藥管理局‘十一五重點專科協(xié)作組膝痹?。ㄏリP(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎）診療方案[4]將KOA分為風寒濕痹證、風濕熱痹證、瘀血閉阻證和肝腎虧虛證，不同證型膝關(guān)節(jié)疼痛程度具有差異性[5]，且血清炎性反應(yīng)指標表達量也存在差異[6]。婦女絕經(jīng)后雌激素水平降低，改變了骨與軟骨代謝，繼而引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變加速，導致KOA發(fā)病率明顯增加[7]。研究發(fā)現(xiàn)，ERRα/SOX9信號通路參與KOA關(guān)節(jié)軟骨病變[8-10]，但其在絕經(jīng)后不同證型KOA關(guān)節(jié)軟骨中表達情況目前仍不明確。因此，本研究通過檢測絕經(jīng)后不同中醫(yī)證型KOA患者軟骨組織中ERRα、SOX9和Col2α1表達水平，探討ERRα/SOX9信號通路與KOA中醫(yī)證型之間的內(nèi)在聯(lián)系，希望能夠為KOA的臨床辨證分型及治療康復提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年4月廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院住院的50～70歲絕經(jīng)后KOA患者40例，根據(jù)“國家中醫(yī)藥管理局‘十一五重點?？茀f(xié)作組專家集體研究的膝痹?。ㄏリP(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎）診療方案[4]將KOA中醫(yī)證型分為肝腎虧虛、瘀血閉阻、風寒濕痹、風濕熱痹4組，每組10例。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 本研究按照2007年中華醫(yī)學會骨科學分會修訂的KOA標準[11]：1）近1個月內(nèi)反復膝關(guān)節(jié)疼痛;2）X線片（站立位）示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和（或）囊性變、關(guān)節(jié)緣骨贅形成;3）關(guān)節(jié)液（至少2次）清亮、黏稠，WBC<2 000個/mL;4）中老年患者（≥40歲）;5）晨僵≤30 min;6）活動時有骨摩擦音（感）。綜合臨床、實驗室及X線檢查。如果患者具備1）、2）或1）、3）、5）、6）或1）、4）、5）、6）則此受試者KOA疾病診斷即成立。

1.2.2 中醫(yī)證型 參照“國家中醫(yī)藥管理局‘十一五重點?？茀f(xié)作組專家集體研究的膝痹?。ㄏリP(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎）診療方案[4]，將KOA的中醫(yī)證型分為以下4個證型，具體的證候表現(xiàn)如下所示：1）風寒濕痹證：表現(xiàn)為肢體關(guān)節(jié)酸楚疼痛、痛處固定，有如刀割或有明顯重著感或患處表現(xiàn)腫脹感，關(guān)節(jié)活動欠靈活，畏風寒，得熱則舒。舌質(zhì)淡，苔白膩，脈緊或濡。2）風濕熱痹證：表現(xiàn)為起病較急，病變關(guān)節(jié)紅腫、灼熱、疼痛，甚至痛不可觸，得冷則舒為特征;可伴有全身發(fā)熱，或皮膚紅斑、硬結(jié)。舌質(zhì)紅，苔黃，脈滑數(shù)。3）瘀血閉阻證：表現(xiàn)為肢體關(guān)節(jié)刺痛，痛處固定，局部有僵硬感，或麻木不仁，舌質(zhì)紫暗，苔白而干澀，脈弦澀。4）肝腎虧虛證：表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)隱隱作痛，腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚，舌質(zhì)紅、少苔，脈沉細無力。

1.3 納入標準 1）符合西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)證型;2）近3個月內(nèi)未接受過相關(guān)治療;3）患者及家屬知情同意。

1.4 排除標準 1）納入對象合并有其他關(guān)節(jié)疾病，例如骨腫瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)結(jié)核、化膿性關(guān)節(jié)炎以及關(guān)節(jié)內(nèi)的骨折急性期等;2）納入對象合并有心血管、腦血管、肺部、肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、惡性腫瘤等嚴重原發(fā)性疾病及精神病患者。

1.5 脫落與剔除標準 納入對象膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物，如注射玻璃酸鈉或激素等。

1.6 研究方法

1.6.1 RT-PCR方法檢測ERRα、SOX9、Col2α1 mRNA表達 對各組軟骨組織處理后進行提取總RNA，以1 μg RNA合成cDNA，GAPDH作為內(nèi)參基因，分別來擴增ERRα，SOX9，PGC1α和Col2α1基因。RT-PCR的反應(yīng)體系為20 μg，設(shè)定反應(yīng)條件為：95 ℃預變性90 s后進行PCR循環(huán)，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共進行40個循環(huán);在擴增反應(yīng)結(jié)束時，可從65 ℃緩慢加熱至95 ℃，并建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線。采用2-△△CT相對定量法來計算各組基因表達情況并進行統(tǒng)計學分析。

1.6.2 Western Blot方法檢測ERRα、SOX9、Col2α1蛋白表達 將各組軟骨組織消化后移至1.5 mL離心管中，離心（10 000×g，5 min，4 ℃），棄上清液，加入裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿器勻漿5 min（30次/s），快速離心30 s，將管壁上的液體離心至離心管的底部。冰上裂解1 h后離心（10 000×g，5 min，4 ℃），用BCA工作液測定蛋白濃度后，取5×Loading buffer加入蛋白液中（Buffer：蛋白液=1∶4）混合均勻后100 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。將蛋白樣品按照蛋白定量結(jié)果按照等體積（每個樣品10 μL）進行蛋白量上樣。250 V恒壓，電泳30 min。電泳結(jié)束后利用恒定電流240 mA，2 h進行濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜移至5%脫脂奶粉中，37 ℃搖床搖動封閉2 h。5%脫脂奶粉稀釋ERRα（1∶1 000;Proteintech）、SOX9（1∶2 000，Proteintech）、PGC1α（1∶500;Proteintech），Col2α1（1∶500;Proteintech），B-Actin（1∶3 000;Proteintech）雜交袋密封轉(zhuǎn)移膜，室溫1.5 h或者4 ℃過夜。將膜至于含有1×TBST的孵育盒中，在室溫下?lián)u動，漂洗5次，5 min/次，將未結(jié)合的一抗洗凈。用5%脫脂奶粉稀釋牛抗兔IgG（1∶3 000;美國SantaCruz公司）或羊抗鼠IgG（1∶3 000;美國SantaCruz公司），雜交袋密封轉(zhuǎn)移膜，在室溫下?lián)u動1 h。將膜至于含有1×TBST的孵育盒中，在室溫下?lián)u動，漂洗5次，5 min/次，將未結(jié)合的二抗洗凈。將ECL發(fā)光液A和B等比例加入曝光盒中混勻，將蛋白膜放入盒子中搖動3 min。吸干膜上液體，將其放入透明的薄膜中。利用Image Lab系統(tǒng)進行曝片。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個實驗重復至少3次，各組間比較采用單因素方差分析，以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨組織中ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表達 各組間膝關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與風寒濕痹組比較，風濕熱痹組ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表達量之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;瘀血痹阻組ERRαmRNA表達量升高，SOX9、Col2α1 mRNA表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1 mRNA表達量降低（P<0.05），SOX9 mRNA表達量升高（P<0.05）。與風濕熱痹組比較，瘀血痹阻組ERRαmRNA表達量升高，SOX9、Col2α1 mRNA表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1 mRNA表達量降低（P<0.05），SOX9 mRNA表達量升高（P<0.05）。與瘀血痹阻組比較，肝腎虧虛組ERRα、Col2α1 mRNA表達量降低（P<0.05）;SOX9 mRNA表達量升高（P<0.05）。見表1，圖1。

2.2 各組軟骨組織中ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表達 各組間膝關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與風寒濕痹組比較，風濕熱痹組ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表達量之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;瘀血痹阻組ERRα蛋白表達量升高，SOX9、Col2α1蛋白表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1蛋白表達量降低（P<0.05），SOX9蛋白表達量升高（P<0.05）。與風濕熱痹組比較，瘀血痹阻組ERRα蛋白表達量升高，SOX9、Col2α1蛋白表達量降低（P<0.05）;肝腎虧虛組ERRα、Col2α1蛋白表達量降低（P<0.05），SOX9蛋白表達量升高（P<0.05）。與瘀血痹阻組比較，肝腎虧虛組ERRα、Col2α1蛋白表達量降低（P<0.05）;SOX9蛋白表達量升高（P<0.05）。見表2，圖2、圖3。

3 討論

中醫(yī)學認為，KOA屬于“膝痹病”范疇，本病是骨傷科臨床的常見病，多發(fā)病[12]?！稄埵厢t(yī)通》闡述了膝痹病“本虛標實、虛實夾雜”的病理特點以及膝痹病與臟腑之間的相互關(guān)系。認為“膝為筋之府，膝痛無有不因肝腎虛者，虛則風寒濕氣襲之”，《景岳全書》對“膝痹病”進行了詳細的描述，認為病因考慮為“風寒濕三氣流注之”。目前KOA的中醫(yī)證型存在多種分型方法，證型仍未統(tǒng)一?！吨嗅t(yī)病癥臨床診斷標準》將KOA癥候規(guī)定為腎虛髓虧型、陽虛寒凝型、瘀血阻滯型之外，還存在兼夾證型，包括腎虛髓虧合并陽虛寒凝型、陽虛寒凝合并瘀血阻滯型、腎虛髓虧合并瘀血阻滯型。但臨床實踐中發(fā)現(xiàn)KOA患者因其生活習慣、地域環(huán)境、氣候因素以及年齡等具體病情可表現(xiàn)為不同的具體證候類型，或單一證型，或多證組合的復合證候并非完全是單一證候[13]。本研究依據(jù)“國家中醫(yī)藥管理局‘十一五重點?？茀f(xié)作組膝痹病（膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎）診療方案[4]將KOA分為風寒濕痹證、風濕熱痹證、瘀血閉阻證和肝腎虧虛證4個證型，通過觀察不同證型之間分子生物學差異，準確地概括病理實質(zhì)，對于提高KOA辨證論治水平以及治療有著重要意義。

KOA關(guān)節(jié)軟骨磨損、退化甚至喪失，軟骨下骨囊性變及硬化，關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生，滑膜出現(xiàn)不同程度的炎性反應(yīng)。其病變過程是由炎性反應(yīng)及代謝因子等一系列問題所導致的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷和疼痛的過程。在不同KOA證型中，以血瘀為主的實證和以腎虛寒凝型為主的虛實夾雜癥與疼痛程度相關(guān)性較高，以氣虛虧虛型為主的虛證的臨床表現(xiàn)越明顯，其疼痛的程度就越低或越不明顯[5]。KOA患者血清中炎性反應(yīng)因子白細胞介素1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的濃度較常人明顯升高，其中瘀血阻滯型中IL-1、IL-6血清濃度最高，而在陽虛寒凝型及風寒濕痹型中TNF-α的濃度較高[6]，解釋了以瘀血、陽虛寒凝型及風寒濕痹型KOA患者膝關(guān)節(jié)不同程度疼痛的原因。鮑啟忠等[14]對KOA患者血清內(nèi)細胞因子和炎性反應(yīng)因子進行了深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KOA不同中醫(yī)證型中風寒濕痹型患者的Wnt-3α和BMP-2表達量明顯高于肝腎陰虛型、脾腎陽虛型和氣滯血瘀型患者;風寒濕痹型患者TNF-α表達量明顯高于肝腎陰虛型、脾腎陽虛型和氣滯血瘀型患者;各中醫(yī)證型IL-6、CRP和ESR比較差異無統(tǒng)計學意義。本研究探討絕經(jīng)后不同KOA證型患者關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα/SOX9/Col2α1信號通路差異，將為中醫(yī)藥辨證施治絕經(jīng)后KOA提供分子生物學機制。

目前研究表明，ERRα具有維持軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的特性，在對OA軟骨細胞反應(yīng)時具有復雜和綜合的作用。軟骨細胞中ERRα與關(guān)節(jié)軟骨的形成、軟骨壽命期間內(nèi)組織的維持和完整性有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)SOX9是軟骨細胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)所必需的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)基因的表達[16]。實驗表明Ⅱ型膠原是軟骨的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占細胞外軟骨基質(zhì)的50%[17]，具有抗拉伸強度和沖擊吸收的特性[18]，Col2α1屬于2型膠原的α1鏈，其突變可導致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，SOX9是ERRα靶基因，敲除ERRα損害SOX9、Col2a1基因表達，引起咽弓異常軟骨形成[15，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，風寒濕痹型和風濕熱痹型與風寒濕痹型比較ERRα表達量升高，SOX9、Col2α1表達量降低;風寒濕痹型和風濕熱痹型與肝腎虧虛型比較ERRα、Col2α1表達量降低，SOX9表達量升高;與瘀血痹阻型比較，肝腎虧虛型ERRα、Col2α1表達量降低;SOX9表達量升高。

總之，絕經(jīng)后婦女不同中醫(yī)證型KOA患者關(guān)節(jié)軟骨組織ERRα/SOX9信號通路表達存在差異，本研究初步闡釋了絕經(jīng)后KOA患者不同中醫(yī)證型的分子生物學機制，將為中醫(yī)藥辨證施治絕經(jīng)后KOA提供理論基礎(chǔ)。

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（2019-12-10收稿 責任編輯：王明）

基金項目：廣東省中醫(yī)藥局科研項目（20181140）

作者簡介：李朋（1982.03—），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)方向，E-mail：156564414@qq.com