清熱祛瘀湯對慢性盆腔炎性疾病模型大鼠的影響

楊成成 季曉黎 文怡 尹小蘭 楊伊斯

摘要 目的：探討清熱祛瘀湯對慢性盆腔炎性疾病模型大鼠的炎性反應細胞因子及粘連相關免疫分子的影響。方法：選取100只Wistar雌性大鼠為研究對象，以隨機分組方式將其分為5組，分別為模型對照組、假手術組、清熱祛瘀湯組（包括低、中、高3種不同劑量），每組20只;除假手術組外，其余5組均建立盆腔炎性疾病大鼠模型;于清熱祛瘀方作用下對其炎性反應細胞因子、血液流變學、粘連相關免疫分子變化情況進行分析。結果：與假手術組比較，模型對照組大鼠血液流變學各指標均明顯升高變（P<0.05）;而經(jīng)治療后，各指標均明顯下降，且與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型對照組與假手術組比較，大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α、IgA、IgG差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;經(jīng)治療后，清熱祛瘀方各劑量組各指標水平均發(fā)生明顯改變（P<0.05）。結論：清熱祛瘀湯對慢性盆腔炎性疾病模型大鼠的炎性反應細胞因子及粘連相關免疫分子、血液流變學均有較大影響，可推廣應用。

關鍵詞 清熱祛瘀湯;慢性盆腔炎性疾病;炎性反應細胞因子;血液流變學;免疫分子;大鼠;粘連相關免疫分子;假手術

Experimental Study on Qingre Quyu Decoction on Inflammatory Cytokines and Adhesion-associated

Immune Molecules in Rats with Chronic Pelvic Inflammatory Disease

YANG Chengcheng，JI Xiaoli，WEN Yi，YIN Xiaolan，YANG Yisi

（Department of Gynecology，Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Qingre Quyu Decoction on inflammatory cytokines and adhesion-related immune molecules in rats with chronic pelvic inflammatory disease.Methods：One hundred female Wistar rats were selected as subjects.They were randomly divided into five groups：model control group，sham operation group and Qingre Quyu Decoction group（including three different doses of low，medium and high），with 20 rats in each group.Except for the sham operation group，the other 5 groups established a rat model of pelvic inflammatory disease; the changes of inflammatory cytokines，hemorheology and adhesion related immune molecules were analyzed under the action of Qingre Quyu Decoction.Results：Compared with sham operation group，the indexes of hemorheology of the model control group were significantly increased（P<0.05）.After treatment，the indexes were significantly decreased，and the differences were Statistically significant compared with the model control group（P<0.05）.There were statistically significant differences in serum IL-4，IL-10，TNF-α，IgA and IgG between model control group and sham operation group（P<0.05）; After treatment，the levels of of indexes in each dose group of Qingre Quyu Decoction significantly changed（P<0.05）.Conclusion：Qingre Quyu Decoction has great influence on inflammatory cytokines，adhesion related immune molecules and hemorheology in chronic pelvic inflammatory disease rats，and can be popularized and applied.

Keywords Qingre Quyu Decoction; Chronic pelvic inflammatory disease; Inflammatory cytokines; Hemorrheology; Immune molecules; Rats; Adhesion-related immune molecules; Sham operation

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.013

盆腔炎性疾病（Pelvic Inflammatory Diseases，PID）為女性常見疾病，為性活躍期女性發(fā)生率較高的一種上生殖道感染性疾病[1-2]。急性期若未得到有效治療，則極易因病程遷延、患者體質差等因素而逐漸形成慢性盆腔炎性疾病（CPID）。而慢性盆腔炎性疾病的病情較為頑固，極易導致患者出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、白帶異常增多、腰腹疼痛等癥狀;且慢性盆腔炎性疾病還可引發(fā)盆腔靜脈曲張，從而誘發(fā)盆腔淤血綜合征，嚴重時甚至可引發(fā)不孕，嚴重影響女性健康[3-4]。如何有效改善患者病情，提高女性生命質量已成為臨床關注的重點。既往，臨床上通常將現(xiàn)代醫(yī)學抗感染等藥物作為治療該病的常用手段，但效果并不理想。且隨著廣譜抗生素的應用，致使藥物耐藥性不斷升高[5-6]。近年來，臨床上逐漸將中醫(yī)療法應用于慢性盆腔炎性疾病患者的治療中?；诖?，本次研究中以盆腔炎性疾病模擬大鼠為研究對象，采用中醫(yī)清熱祛瘀湯進行治療，并分析該湯藥對大鼠炎性反應細胞因子、粘連相關免疫分子、血液流變學等的影響，以闡明該療法在慢性盆腔炎性疾病中的應用效果。具體研究如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取100只SPF級Wistar雌性大鼠為研究對象，所有大鼠均由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2004-0006-0000010;大鼠鼠齡10～14周，平均鼠齡（12.2±0.8）周;大鼠體質量190～248 g，平均體質量（219.9±15.4）g，保持環(huán)境溫度22～25 ℃，濕度40%，明暗光照12 h/12 h，自由飲食。動物倫理學內(nèi)容（倫理審批號：20180221）。

1.1.2 藥物 清熱祛瘀湯方組成主要為：白芷、紅藤、沒藥、延胡索、土茯苓、當歸、野菊花、五靈脂、黃柏、赤芍、乳香、丹參。方中所用藥材均由成都中醫(yī)藥大學炮制實驗室提供，且所有藥材均經(jīng)專業(yè)人員鑒定，滿足藥典質量要求。上述諸藥均加水浸泡2 h，然后用水煎煮，對濾液進行過濾、合并，然后將其濃縮至規(guī)定濃度，最后進行冷藏備用。

1.1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛（中國白鶴化工廠提供，批號：980101），酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海易莎生物科技有限公司提供，批號：E20160903）;多功能酶標儀（Tecan集團奧地利有限公司，型號：Tecan Infinite M200 PRO），電子計價秤（廣東香山有限公司，型號：ACS-30-JE11），型恒溫水浴鍋（河北潤連機械設備有限公司，型號：HHS-2S），冰箱（上海拓紛制冷設備有限公司，型號：BCD-290W），移液槍（上海醫(yī)樂醫(yī)用光學儀器廠，型號：DY47914），全自動血液流變儀（北京中勤世帝科學儀器有限公司，型號：LG-R-80A），全自動血液黏度儀（北京中勤世帝科學儀器有限公司，型號：LG-R-80E），離心機（上海云樓醫(yī)用儀器廠，型號：80-1）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 以隨機分組方式將100只大鼠分為5組，分別為模型對照組、假手術組、清熱祛瘀湯組高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組20只;各組大鼠均進行為期1周的適應性飼養(yǎng)。然后以10%水合氯醛進行麻醉處理，麻醉起效后，以仰臥體位固定大鼠，在大鼠下腹部手術部位行去毛處理，常規(guī)消毒，沿腹中線在尿道口上方10 mm處做8～10 mm長的切口，對右側子宮進行暴露，然后在距離卵巢20 mm部位，以5號針頭將子宮劃傷，然后向右側輸卵管-卵巢方向注入0.05 mL濃度為25%的苯酚膠漿溶液;然后逐層關閉腹腔，建立盆腔炎性疾病模型，完成造模。然后假手術組大鼠，在切開暴露后，直接進行關閉腹腔及消毒處理;術后，所有大鼠均常規(guī)進行為期1周的飼養(yǎng)

1.2.2 給藥方法 第8天開始，依照人和大鼠藥量換算方式對用藥劑量進行換算，然后分別進行藥物灌胃處理，其中假手術組與模型組均以10 mL/kg蒸餾水行灌胃處理，低劑量組以5.3 g/kg的清熱祛瘀湯進行灌胃處理，中劑量組與高劑量組則分別以10.5 g/kg、21.0 g/kg的清熱祛瘀湯灌胃;各組均灌胃1次/d，連續(xù)治療4周。

1.2.3 檢測指標與方法 最后1次給藥后24 h，將禁食不禁水16 h的大鼠以350 mg/kg濃度為10%的水合氯醛行腹腔麻醉處理，麻醉起效后，行破腹處理，采集腹主動脈血6 mL，并以1∶125單位抗凝。然后取經(jīng)肝素抗凝的全血0.8 mL，將其置于全自動血液流變儀、全自動血液黏度儀進行測定，測量指標包括全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度、紅細胞壓積等;剩余全血以4 000 r/min，離心半徑15.0 cm，離心5 min）進行離心處理;然后取0.8 mL血漿置于全自動血液流變儀上行血漿黏度測定。取在-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆玫难暹M行炎性反應細胞因子及粘連相免疫分子測定，包括IgA、IgG、IL-4、IL-10、TNF-α個指標均選用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，并嚴格按照試劑盒相關說明書進行測定。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用例（%）表示，進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血液流變學情況比較 與假手術組比較，模型對照組大鼠血液流變學各指標均明顯升高變（P<0.05）;而經(jīng)治療后，各指標均明顯下降，且與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組炎性反應因子水平比較 模型對照組與假手術組比較，大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;經(jīng)治療后，清熱祛瘀方各劑量組各指標水平均發(fā)生明顯改變（P<0.05）。見表2。

2.3 各組相關免疫分子指標比較 模型對照組與假手術組比較，大鼠血清IgA、IgG差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;經(jīng)治療后，清熱祛瘀方各劑量組各指標水平均發(fā)生明顯改變（P<0.05）。見表3。

2.4 清熱祛瘀湯大鼠子宮病理學影響研究 正常對照組大鼠子宮組織結構正常，壁界清晰，無明顯充血點及炎性浸潤表現(xiàn);模型組大鼠可見明顯炎性細胞浸潤，結締組織增生明顯，黏膜上皮細胞可見明顯變性、壞死區(qū);經(jīng)清熱祛瘀湯干預后，大鼠子宮組織結構恢復正常，炎性細胞浸潤及組織增生減少。見圖1。

3 討論

慢性盆腔炎性疾病也叫盆腔炎性疾病后遺癥，其主要是指女性內(nèi)生殖器及周圍結締組織、盆腔腹膜的慢性炎性反應，具有病程長、易復發(fā)等特點[7-8]。多是因急性盆腔炎性疾病未能得到及時、徹底治療，致使病情遷延、反復發(fā)作所致。慢性盆腔炎性疾病患者多可見盆腔組織增厚、粘連、下腹疼痛、白帶異常等現(xiàn)象，嚴重者甚至可引發(fā)不孕等嚴重后果，對女性健康乃至家庭生命質量造成嚴重影響[9]?？咕幬餅榕R床上治療該病的常用方式，然而長期或反復予以患者多種抗菌藥物聯(lián)合治療往往難以取得理想效果。

近年來，臨床上逐漸將中醫(yī)應用于該病的治療中，中醫(yī)認為，慢性盆腔炎性疾病屬于“腹痛”“癥瘕”“帶下”等范疇[10]，認為該病的發(fā)生與血瘀、濕熱有較大關聯(lián)，而濕熱內(nèi)停、反復進退、邪毒內(nèi)存、正氣不足則是導致該病發(fā)生的重要病機。因此，中醫(yī)通常將活血化瘀、清熱利濕作為治療該病的關鍵。本研究中所選用的清熱祛瘀湯，其方中所含有的野菊花、紅藤、土茯苓等藥物均有清熱解毒、活血通絡、散瘀的功效;與黃柏相配伍，可促使清熱效果增強;延胡索則均具有辛散溫通的功效;而沒藥、當歸、乳香、五靈脂、赤芍、丹參等藥物則具有消腫止痛、行氣活血的作用;與白芷相配伍則可發(fā)揮通滯散結的功效;且丹參與赤芍配合使用還可達到調(diào)經(jīng)止痛、活血化瘀的功效;且赤芍還有良好的抗炎功效，可對炎性反應細胞浸潤進行有效抑制，從而可達到促進黏膜上皮細胞功能恢復、細胞分泌活動增強的效果;而丹參則具有促纖溶功效，在促進纖溶蛋白溶解、緩解組織粘連方面可發(fā)揮積極作用;當歸則可在一定程度上對血小板聚集現(xiàn)象進行改善，并可促進非特異性免疫功能增強;諸藥合用可達到清熱利濕、活血化瘀、行氣止痛的功效[11]。將其應用于慢性盆腔炎性疾病的治療中可發(fā)揮一定的積極作用，對改善患者病情有重要意義。

臨床上通常認為，慢性盆腔炎性疾病遷延不愈與盆腔血液循環(huán)障礙有較大關聯(lián);臨床多項研究顯示[12]，盆腔炎性疾病后遺癥患者多伴有血液凝滯、黏稠狀態(tài)，而血瘀證則與血液流變學存在較大關聯(lián)。本次研究結果提示清熱祛瘀湯在改善慢性盆腔炎性疾病患者血液流變學方面可發(fā)揮積極作用。另外，中醫(yī)認為，慢性盆腔炎性疾病的發(fā)生與濕熱有較大關聯(lián);而濕熱的發(fā)生則與慢性炎性反應有較大關聯(lián)。體內(nèi)細胞因子異常應答則與慢性炎性反應的發(fā)生有較大關聯(lián)。盆腔炎性疾病患者多可見Th細胞亞群偏離現(xiàn)象，IL-4、IL-10均屬于抑炎性細胞因子，兩者均有Th2細胞產(chǎn)生;其中IL-4有較強的抗炎活性，可有效的對脂多糖介導的炎性細胞因子進行抑制，并可在一定程度上對TNF-a及前列腺素E2的分泌情況進行抑制，進而可達到抗炎性反應糖皮質激素的功效。而IL-4則可對促炎性反應細胞因子進行抑制，從而可在一定程度上減輕因炎性細胞因子所致的過強免疫反應，進而可達到減輕自身免疫應答的功效。TNF-a則可在炎性反應發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)功效[13-14]。免疫球蛋白IgA、IgG則是體液免疫的主要組成部分，屬于具有抗體活性的蛋白質，可會較好的抗病毒、抗菌功效，可在機體抗感染免疫中發(fā)揮重要價值。本次研究結果提示清熱祛瘀湯可在一定程度上對體液免疫反應進行調(diào)節(jié)，并可對變態(tài)反應形成進行有效抑制，從而可發(fā)揮較好的抗感染、抗炎功效，進而可達到減輕患者炎性癥狀的效果。

綜上所述，清熱祛瘀湯對慢性盆腔炎性疾病模型大鼠的免疫分子、血流動力、血清炎性反應因子水平均有較好的調(diào)節(jié)作用，可在一定程度上減輕盆腔炎性疾病癥狀，對防治盆腔炎性疾病有重要價值，可在臨床上推廣應用。

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（2019-07-03收稿 責任編輯：王明）

基金項目：四川省教育廳科研計劃項目（17ZB0154）

作者簡介：楊成成（1986.03—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治婦科痛癥，E-mail：3086827810@qq.com

通信作者：楊伊斯（1987.01—），女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治婦科疾病，E-mail：150393856@qq.com