橙皮苷對果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠的作用研究

李曉霞 許瑩 徐波 鄭小嵐 張?jiān)? 韓菊平

摘要 目的：研究橙皮苷對高果糖加高脂飼料飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）表達(dá)的影響。方法：昆明小鼠60只，雄性，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥物多烯磷脂酰膽堿組，以及橙皮苷低、中和高劑量組，每組10只，除正常組給予普通飼料和普通水喂養(yǎng)外，其余5組給予10%的果糖水+高脂飼料喂養(yǎng)8周構(gòu)建NAFLD模型，治療4周后處死，檢測肝功能AST、AST，血脂和肝脂TG、TC，觀察肝臟病理學(xué)，同時(shí)檢測肝臟組織中PPARα和SREBP-1c蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果：肝臟病理學(xué)HE染色可見，正常組切片正常，模型組出現(xiàn)明顯脂肪空泡，與模型組比較，各觀察組均有明顯好轉(zhuǎn);與正常組比較，模型組AST、ALT、血清TG、血清TC、肝臟TC和肝臟TG均明顯升高（P<0.05），各觀察組相較于模型組明顯降低（P<0.05），此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組比較，模型組PPARα明顯降低（P<0.05），SREBP-1c明顯升高（P<0.05），橙皮苷治療后PPARα明顯升高（P<0.05），SREBP-1c則明顯降低（P<0.05），此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組沒有差異。結(jié)論：橙皮苷可明顯降低高果糖+高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟組織中SREBP-1c表達(dá)，同時(shí)升高PPARα表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)肝臟。

關(guān)鍵詞 橙皮苷;果糖;非酒精性脂肪肝;小鼠;過氧化物酶體增殖物激活受體α;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c

Effects of Hesperidin on Nonalcoholic Fatty Liver Rats Induced by High Fructose Diet

LI Xiaoxia1，2，XU Ying1，XU Bo1，ZHENG Xiaolan1，ZHANG Yuanjie1，HAN Juping1，2

（1 The Fifth Hospital of Wuhan，Wuhan 430050，China; 2 The Second Affiliated Hospital，

Jianghan University，Wuhan 430050，China）

Abstract Objective：To study the effect of hesperidin on peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPARα）and sterol regulatory element binding protein 1 c in high-fructose and high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）mice.Methods：A total of 60 male Kunming mice were randomly divided into a normal group，a model group，a positive drug polyene phosphatidylcholine group，and a hesperidin low，medium and a high dose groups，with 10 in each group.Except for the normal group being fed with ordinary feed and ordinary water，the other 5 groups were fed with 10% fructose water+high-fat feed for 8 weeks to construct a NAFLD model.After 4 weeks of treatment，the mice were sacrificed and detected the liver function AST，AST，blood lipids and hepatic lipids TG，TC.Liver pathology was observed and the expression of PPARα and SREBP-1c protein and mRNA in liver tissue was detected.Results：Hepatic pathology HE staining showed that the slices in normal group was normal，and in the model group showed obvious fat vacuoles.Compared with the model group，each observation group were improved significantly.Compared with the normal group，AST，ALT，serum TG，serum TC，liver TC and liver TG in the model group were significantly increased（P<0.05），and the observation groups were significantly lower than them in the model group（P<0.05），there was no difference between the hesperidin high dose group and the polyene phosphatidylcholine group.Compared with the normal group，the PPARα was significantly lower in the model group（P<0.05），SREBP-1c was significantly higher（P<0.05），and the PPARα was significantly increased after hesperidin treatment（P<0.05），and SREBP-1c was significantly lower（P<0.05）.In addition，there was no difference between the high dose hesperidin group and the polyene phosphatidylcholine group.Conclusion：Hesperidin can significantly reduce the expression of SREBP-1c in the liver tissue of NAFLD mice induced by lowing high fructose+high fat diet，and increase the expression of PPARα，thereby regulating blood lipids and protecting liver.

Keywords Hesperidin; Fructose; Nonalcoholic fatty liver（NAFLD）; Mouse; Peroxisome proliferators-activated receptor α（PPARα）; Sterol regulatory element binding protein 1c

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.011

非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是臨床中常見的一種脂代謝紊亂型疾病，本病與中心性肥胖、高血壓、高血脂、高血糖和胰島素抵抗等多種疾病密切相關(guān)，發(fā)生機(jī)制目前國內(nèi)外接受的主要為二次打擊學(xué)說[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食特別是高果糖高脂飲食可能是本病的發(fā)生核心之一，且可能是二次打擊學(xué)說中第一次打擊形成的核心因素[3]。目前對于高果糖脂肪肝病的研究還缺少相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究著眼于此，采用高果糖高脂飲食構(gòu)建NAFLD小鼠模型，采用橙皮苷（橙皮苷具有較強(qiáng)和廣泛的藥理活性，已有的研究顯示，橙皮苷在抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫力等多方面均具有很好的應(yīng)用價(jià)值[4]。治療之后，從過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome Proliferators-activated Receptor α，PPARα）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Sterol Regulatory Element-binding Protein-1c，SREBP-1c）研究并分析橙皮苷對其的作用機(jī)制，為今后高果糖脂肪肝病的治療提供夯實(shí)的理論學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 小鼠、小鼠飼料和高脂飼料均購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠為昆明種小鼠，體質(zhì)量20～22 g，合格證號：SCXK（鄂）2008-010），SPF級，共60只，雄性（雌性可分泌雌性激素，雌性激素對脂肪肝本身有一定的治療作用，所以全部選用雄性大鼠），在購買后飼養(yǎng)于武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～26 ℃，濕度55%～65%，光照/黑暗=12 h/12 h，倫理審批號：五醫(yī)倫理KY【YJ2018009】。

1.1.2 藥物 橙皮苷（98%）購于雅安太時(shí)生物科技股份有限公司，貨號：520-26-3;多烯磷脂酰膽堿購于賽諾菲安萬特（北京）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20059010。

1.1.3 試劑與儀器 果糖（98%）（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，貨號：ZCC-20516）;蘇木素伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色液（江蘇碧云天生物科技公司，貨號：C0105M）;肝臟三酰甘油（Triglyceride，TG）（貨號：A110-2-1）和肝臟總膽固醇（Total Cholesterol，TC）（貨號：A111-2-1）試劑盒購于南京建成生物工程研究所;過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome Proliferators-activated Receptor α，PPARα）抗體（貨號：sc-398394）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Sterol Regulatory Element-binding Protein-1c，SREBP-1c）抗體（貨號：sc-365513）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrog Nase，GAPDH）抗體（貨號：sc-47724），購于美國Santa公司;二抗（北京中杉金橋生物科技公司，貨號：ZB-2301）;引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：S0131]。

電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DK-S22）;高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：TGL-16C）;高速組織勻漿機(jī)（金壇市宏華儀器廠，型號：FHS-2A）;分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表公司，型號：759S）;全自動(dòng)生化分析儀（羅氏公司，瑞士，型號：RL7600D）;顯微鏡（廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號：B5-223IEP）;切片機(jī)（萊卡公司，德國，型號：RM2245L）;蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：Mini-protean）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：ProFlexTM]。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[5]，64只小鼠在購買后即分組，其中12只為正常組，其余52只為造模組，造模時(shí)正常組只給予普通飼料和蒸餾水喂養(yǎng)，造模組則給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)日常飲用10%的果糖水，連續(xù)喂養(yǎng)8周。8周后，正常組和模型組各抽取2只小鼠，收集肝臟做病理學(xué)切片，當(dāng)病理學(xué)切片結(jié)果小鼠肝臟有明顯脂肪空泡時(shí)確認(rèn)造模成功。造模成功后，基于隨機(jī)數(shù)字發(fā)，將造模組其余50只小鼠分為5組，分別為模型組、多烯磷脂酰膽堿組、橙皮苷低、中和高劑量組，每組10只。

1.2.2 給藥方法 治療時(shí)正常組和模型組給予5 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，多烯磷脂酰膽堿觀察組給予多烯磷脂酰膽堿23.3 mg/（kg·d）治療、橙皮苷低、中和高劑量組則分別給予橙皮苷80 mg/（kg·d）、160 mg/（kg·d）和320 mg/（kg·d）治療，連續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 組織收集方法 治療4周后，各組小鼠給予禁食不禁水12 h，以第4周末，各組小鼠禁食不禁水12 h后，以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后固定于解剖版，腹主動(dòng)脈取血法收集小鼠血液，血液收集后立即離心，3 000 r/min，離心半徑5 cm，離心10 min后，后收集血清，一部分交由我院檢驗(yàn)科完成肝功能AST、ALT、血脂TG和TC的檢測，其余置入超低溫冰箱中保存。完成后，統(tǒng)一將肝左葉置入福爾馬林溶液中保存用于病理學(xué)檢測，其余組織分成四小塊用于TG、TC和相關(guān)蛋白酶及mRNA表達(dá)的檢測。

1.2.3.2 肝脂指標(biāo)檢測方法 肝臟TG和TC的檢測，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行，之后采用分光光度計(jì)檢測得到數(shù)值，根據(jù)試劑盒說明書提供的計(jì)算公式計(jì)算即完成。

1.2.3.3 組織病理學(xué)檢測 從福爾馬林溶液中取出肝臟組織后，按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[6]，自來水沖洗24 h，乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、切片機(jī)切片、蘇木精染色，伊紅復(fù)染，中性樹脂封片。完成后顯微鏡下收集圖像即可，每個(gè)切片選取4個(gè)不同的視野。

1.2.3.4 Western-blot檢測PPARα和SREBP-1c蛋白表達(dá)水平 選用組織蛋白裂解液將組織充分碾磨后提取上清，采用BCA法對其定量后調(diào)平，然后每組取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h，一抗過夜孵育后于次日取出，TBS/T洗滌3次后，加入二抗1 h，暗室曝光洗片收集圖像，采用Image J比較各組條帶的灰度值即可。

1.2.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測PPARα和SREBP-1c mRNA表達(dá)水平 用天根總RNA試劑盒提取總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，完成后對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s（38 cycle），引物設(shè)計(jì)為，PPARα上游：5′-AGTTC GGTAACCTACGTGCC-3′;下游：3′-CACGTGTAACAAGTGGGGAC-5′;產(chǎn)物長度為：162bp;SREBP-1c上游：5′-CAGTGATCATGGACTCTGCC-3′;下游：3′-CACAGGGTAATGCGGTAGAC-5′;產(chǎn)物長度為：162bp;GAPDH;上游：5′-CTCCATACGGTATCACACGC-3′;下游：3′-CAGGCATTGGAAGATCGGAC-5′;產(chǎn)物長度為：128 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。計(jì)量資料采用組間t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢測 正常組肝臟切片HE染色可見肝細(xì)胞大小均一，細(xì)胞核分布均勻，切片表面光滑，沒有任何脂肪顆粒浸潤，而模型組表面粗糙，彌漫有大量脂肪空泡，同時(shí)細(xì)胞核受到了明顯擠壓，與模型組比較，各觀察組均有一定好轉(zhuǎn)。見圖1。

2.2 小鼠肝功能 與正常比較，模型組肝功能指標(biāo)AST和ALT均明顯升高（P<0.05），各觀察組相較于模型組明顯降低（P<0.05），此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 小鼠血脂指標(biāo) 與正常比較，模型組血脂指標(biāo)TG和TC均明顯升高（P<0.05），各觀察組相較于模型組明顯降低（P<0.05），此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4 小鼠肝脂指標(biāo) 與正常比較，模型組肝脂TG和TC均明顯升高（P<0.05），各觀察組相較于模型組明顯降低（P<0.05），此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.5 蛋白和mRNA表達(dá)的檢測 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中PPARα蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低。而SREBP-1c表達(dá)則明顯升高（P<0.05），而多烯磷脂酰膽堿組和橙皮苷組相較于模型組PPARα表達(dá)則明顯升高，而SREBP-1c明顯降低（P<0.05），橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2，表4。

3 討論

過去的研究認(rèn)為NAFLD是一種良性病變，一般不會給身體帶來較大的損害，但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究結(jié)果表明，NAFLD危害極大，其是多種慢性肝臟病變的早期階段，控制不及時(shí)可引發(fā)患者發(fā)生肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等，此外本病也可引起動(dòng)脈硬化、冠心病等多種心血管疾病，因此當(dāng)前NAFLD已經(jīng)引起國內(nèi)外眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注[7-8]。過去的研究認(rèn)為NAFLD主要由高脂高糖飲食所引起[9]，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)[10]，人們?nèi)粘Ｉ钪刑貏e是飲料中的高果糖也是本病發(fā)生的因素之一，且可能是近年來NAFLD發(fā)生率逐年升高的關(guān)鍵。目前國內(nèi)外對于高果糖飲食動(dòng)物模型的構(gòu)建還沒有統(tǒng)一定論，文獻(xiàn)報(bào)道的高果糖飲食所構(gòu)建的NAFLD模型主要有2種[11-12]，一種為20%～30%的高果糖水日常飲用8～18周，另一種為10%的果糖水溶液+高脂飲食飼養(yǎng)6～12周所構(gòu)建的NAFLD模型。考慮到日常人們飲食中的習(xí)慣，本次研究最終采用了第2種方法構(gòu)建NAFLD模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的肝功能和血脂異常，同時(shí)肝臟病理學(xué)也呈現(xiàn)出明顯的脂肪顆粒浸潤，這證明了本研究模型成功構(gòu)建。

橙皮苷是我國中藥陳皮中的主要成分[13]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[14]，其主要存在于柑橘屬植物果實(shí)中，自身結(jié)構(gòu)為二氫黃酮類化合物。橙皮苷是一種新的維生素并被命名為維生素P，主要功能為保護(hù)血管，降低毛細(xì)血管通透性，此外也可以延長壞血病患者的生存率[15]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，橙皮苷具有多種藥理活性，常見的如抗氧化和清除有害自由基，此外其還有抗炎、抗病毒以及抗過敏等多種藥理活性。關(guān)于其對高脂飲食所構(gòu)建的NAFLD動(dòng)物模型的治療也有文獻(xiàn)報(bào)道，如國內(nèi)學(xué)者蔡莉等[17]采用高脂飼料構(gòu)建了NAFLD模型，發(fā)現(xiàn)橙皮苷可明顯降低其肝功能，并分析其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)抗氧化實(shí)現(xiàn)的，此外其他學(xué)者也進(jìn)行了相似的研究[18-19]，均證明橙皮苷對脂肪肝并具有很好的作用，但是對高果糖飲食所構(gòu)建的NAFLD動(dòng)物模型還沒有文獻(xiàn)報(bào)道，本次采用橙皮苷治療高果糖高脂飲食所構(gòu)建的NAFLD動(dòng)物模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，橙皮苷3個(gè)觀察組均可以明顯降低肝功能指標(biāo)AST、AST，同時(shí)降低肝臟和血液中TG和TC的含量，這提示橙皮苷對果糖脂肪肝小鼠肝功能和血脂具有明顯的保護(hù)作用。

脂肪肝的核心影響因素為脂質(zhì)代謝，近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝不僅可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝本身，其還在抗脂質(zhì)過氧化以及抑制炎性反應(yīng)等多方面具有重要的作用，在所有的氧化基因中，PPARα和SREBP-1c與其關(guān)系密切[20]。其中SREBP-1c主要調(diào)控功能為脂肪酸的合成，其屬于維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，此外近年來研究發(fā)現(xiàn)，在中醫(yī)證候中，其還是多種代謝綜合征癥候群的調(diào)控連接點(diǎn)[21]。PPARα是肝臟中大量表達(dá)的一類配體激活核轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能為調(diào)控脂肪酸的氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)以及紙質(zhì)存儲，此外其還可以通過調(diào)節(jié)線粒體功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)過氧化物酶體的β氧化、降低炎性反應(yīng)浸潤[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，高果糖水+高脂飼料喂養(yǎng)可明顯升高肝組織中SREBP-1c的表達(dá)，同時(shí)降低PPARα蛋白及mRNA的表達(dá)，而橙皮苷則可以明顯降低SREBP-1c，升高PPARα表達(dá)，此外橙皮苷高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組基本一致，這提示，橙皮苷對改善果糖脂肪肝指脂代謝具有很好的作用。

綜上所述，本次研究結(jié)果表明，10%的高多糖+高脂飼料喂養(yǎng)8周可形成果糖脂肪肝模型，其模型具有明顯的肝功能、血脂和肝脂的異常，而橙皮苷則可以明顯改善肝功能，降低肝脂和血脂，這與橙皮苷可以調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因PPARα和SREBP-1c的表達(dá)有關(guān)。

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（2019-09-05收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：湖北省衛(wèi)生計(jì)生委應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（WX17D32）

作者簡介：李曉霞（1984.07—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化道動(dòng)力及腫瘤，E-mail：qwe201908@163.com

通信作者：韓菊平（1970.03—），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤及肝膽疾病，E-mail：47736196@qq.com