止嗽散對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道炎性反應(yīng)及外周血Th1/Th2平衡的影響

胡佳 沈波

摘要 目的：探討止嗽散對咳嗽變異性哮喘大鼠氣道炎性反應(yīng)及外周血Th1/Th2平衡的影響。方法：48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組（0.2 mg/kg）、止嗽散高（12.6 g/kg）、中（6.3 g/kg）、低（3.1 g/kg）劑量組，每組8只。以卵白蛋白（OVA）致敏激發(fā)法制備大鼠咳嗽變異性哮喘模型，檢測各組大鼠血液中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞含量，采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）測定血清和肺泡灌洗液（BALF）中IL-4和IFN-γ水平，同時做肺臟的組織病理學(xué)檢測。結(jié)果：止嗽散高劑量組大鼠血液嗜酸性粒細(xì)胞絕對值、淋巴細(xì)胞絕對值降低，血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）;同時能夠改善肺臟組織炎性細(xì)胞浸潤，減輕纖維結(jié)締組織增生。結(jié)論：止嗽散可以通過降低血清和BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫失衡，改善咳嗽變異性哮喘癥狀。

關(guān)鍵詞 止嗽散;咳嗽變異性哮喘;白細(xì)胞介素4;γ-干擾素;氣道炎性反應(yīng);免疫平衡

Effects of Zhisou Powder on Airway Inflammation and Th1/Th2 Balance

in Peripheral Blood of Rats with Cough Variant Asthma

HU Jia，SHEN Bo

（Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Affiliated

with Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 240014，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Zhisou Powder on airway inflammation and Th1/Th2 balance in peripheral blood of rats with cough variant asthma.Methods：A total of 48 male SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，a dexamethasone group（0.2 mg/kg），a Zhisou Powder high-dose（12.6 g/kg），a medium-dose（6.3g/kg）and low-dose（3.1 g/kg）groups，with 8 rats in each group.Sensitized with ovalbumin（OVA）excitation of cough variant asthma model rats，each rat blood eosinophils and neutrophils and lymphocytes in content was detected.Enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）was used to determine serum and alveolar lavage fluid（BALF）of IL-4 and IFN-gamma level.At the same time lung tissue pathology testing was done.Results：The absolute value of eosinophil and lymphocyte in blood of rats，the content of IL-4 and IFN-γ in serum and BALF in Zhisou Powder high-dose group were decreased，and the differences were significant compared with model group（P<0.01，P<0.05）.At the same time，it can improve inflammatory cell infiltration of lung tissue and reduce fibrous connective tissue hyperplasia.Conclusion：Zhisou Powder can reduce the content of IL-4 in serum and BALF，increase the content of IFN-γ，regulate the immune imbalance of Th1/Th2 and improve the symptoms of cough variant asthma.

Keywords Zhisou Powder; Cough variant asthma; IL-4; IFN-γ; Airway inflammation; Immunologic balance

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.009

咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA），又稱咳嗽性哮喘，是以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的一種特殊類型哮喘。調(diào)查顯示，我國CVA已占慢性咳嗽病因診斷中的14%～62%，成為慢性咳嗽的主要原因之一[1-2]，長期西藥治療的患者療效較不顯[3]。本研究擬從止嗽散對CVA大鼠氣道炎性反應(yīng)及外周血Th1/Th2平衡的關(guān)系著手，以動物模型為載體，探討止嗽散的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級的SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（200±10）g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。在給SD大鼠上藥前后，分別將其安放在不同的籠內(nèi)飼養(yǎng)，每只籠內(nèi)5只，喂食飼料為全價顆粒鼠飼料（南京協(xié)同生物工程有限公司提供），讓其自由飲水及飲食，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，人工光照時間達(dá)到12 h/d，保持良好的室內(nèi)通風(fēng)，所在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對濕度維持在：65%～70%。本研究得到南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并在此批準(zhǔn)下進(jìn)行（倫理審批號：寧中西倫字【2018】23號）。

1.1.2 藥物 止嗽散組方：桔梗（炒）10 g、荊芥10 g、紫菀10 g、百部10 g、白前10 g、炙甘草5 g、陳皮5 g，對上述中藥進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制后由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室深加工，煎成水劑，濃縮至200 mL，備用。

1.1.3 試劑與儀器 地塞米松（浙江省仙琚制藥股份有限公司，批號：1505102）;卵白蛋白OVA（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：709B051）;氫氧化鋁干粉（上海美興化工股份有限公司，批號：14100）;IFN-γELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：E20171001A）;IL-4 ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：E20171001A）;全波長酶標(biāo)儀（Thermofisher Scientific公司，美國，型號：Synergy HT）;分析天平（島津公司，日本，型號：AUW120D）;魚躍霧化器（武漢科康興達(dá)醫(yī)療器械有限公司，型號：403M）;血液分析儀（SIEMENS公司，德國，型號：ADVIA 2120i）

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 健康SD大鼠以新制的10%卵蛋白（OVA）和氫氧化鋁混合物1 mL，皮下注射致敏，每只大鼠共取10處，分別為：兩后足跖部、腹股溝部、腰部、背部、頸部，每處給其注射0.05 mL，同時注射0.5 mL在腹腔，1周后再加強(qiáng)1次。造模后第15天的上午行霧化吸入：將大鼠放在4 L玻璃制鐘罩內(nèi)，在400 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）恒壓下，用超聲霧化器將1% OA溶液噴入20 min，從而激發(fā)大鼠哮喘。模型評估：在激發(fā)大鼠時觀察其反應(yīng)，咳嗽、豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔、極度煩躁，以上癥狀出現(xiàn)2種或2種以上者，或出現(xiàn)抽搐、虛脫2種現(xiàn)象之一，判定為造模成功[4-7]。將48只大鼠隨機(jī)分為以下6組：正常對照組、模型對照組、地塞米松組，止嗽散低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2 干預(yù)方法 造模成功后，給組大鼠連續(xù)給藥14 d，第15天處死大鼠，留取標(biāo)本。地塞米松組給藥劑量為0.2 mg/kg（相當(dāng)于60 kg體質(zhì)量成人用量），止嗽散給藥劑量分別為高劑量組（12.6 g生藥/kg），中劑量組（6.3 g生藥/kg）、低劑量組（3.1 g生藥/kg），大鼠造模成功后灌胃給藥，1次/d，高、中、低劑量組給藥量分別相當(dāng)于60 kg體質(zhì)量成人用量的5、10、15倍。正常對照組、模型組同步以蒸餾水灌胃，1次/d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 血清制備 末次給藥后先將大鼠禁食（可自由飲水）24 h，腹腔注射烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉，眼眶取血，部分血液做血常規(guī)檢測，部分血液3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上層血清，-20 ℃貯存待檢測。

1.2.3.2 大鼠肺泡灌洗液（BALF）制備 取血后，采用仰臥位將大鼠固定于操作臺。把大鼠頸部皮膚剪開，使其氣管充分暴露在外，剪一小口于氣管正中處，將右肺門根部結(jié)扎。氣管插管使用外徑1.8 cm的靜脈導(dǎo)管，感到輕阻時，判斷插管已到達(dá)氣管隆突部，將插管向左旋轉(zhuǎn)，輕微用力后方可成功進(jìn)入左主支氣管，新阻力遇到時即停止插管，這時表明導(dǎo)管已到左主支氣管下端分叉。用5 mL的注射器抽入37 ℃生理鹽水4 mL，將鹽水用導(dǎo)管慢速注入肺內(nèi)，肉眼可見左肺漸漸蒼白、膨大。輕按30 s肺組織，隨后將注射器緩慢回抽，再在肺內(nèi)緩慢注入所得液體，重復(fù)操作10次，末次操作時，一邊回抽鹽水一邊緩慢外拔插管約3.5 cm至氣管，隨后把回抽液放入15 mL塑料離心管（冰浴中）。以上操作為第1次灌注，其后重復(fù)上述操作3次，將3次收集的BALF均勻混合，回收液以1 500 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，取上清液，-20 ℃貯存待檢測。

1.2.3.3 大鼠肺組織制備 BALF收集完畢后，將動物處死，取組織，定位于右肺下葉相近部位，10%甲醛固定組織，以常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5 μm，HE染色。HE染色步驟：60 ℃恒溫烤箱烤片（2 h），二甲苯I（6 min），二甲苯Ⅱ（5 min），無水乙醇I（2 min），無水乙醇Ⅱ（2 min），95%乙醇（1 min），80%乙醇（1 min），70%乙醇（1 min），自來水水洗3次，將水控凈后蘇木精（3 min），自來水水洗3次，1%鹽酸乙醇分化（5s），自來水水洗3次，0.5%氨水返藍(lán)（30 s），自來水水洗3次，1%伊紅水溶液（2 min），自來水水洗3次，70%乙醇（1 min），80%乙醇（1 min），95%乙醇（1 min），無水乙醇I（2 min），無水乙醇Ⅱ（2 min），無水乙醇Ⅲ（2 min），二甲苯I（1 min），二甲苯Ⅱ（3 min），二甲苯Ⅲ（3 min），中性樹膠封片。

1.2.3.4 IFN-γ、IL-4 ELISA檢測步驟 先將試劑盒平衡至室溫（20～28 ℃），再把標(biāo)準(zhǔn)品依照每孔各 （50 μL）做標(biāo)記;把處理好的待測樣本按每孔各（50 μL）依次加入并標(biāo)記;將（50 μL）酶聯(lián)親和物分別加入至標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣本孔中，充分搖勻。將包被微孔板覆膜，在37 ℃孵育反應(yīng)60 min，然后充分棄盡孔內(nèi)剩余殘夜，用事先稀釋準(zhǔn)備好的清洗液重復(fù)沖洗5次，并將孔內(nèi)剩余液扣干;將底物Ⅰ和Ⅱ各（50 μL）依次加入每孔，充分的搖勻。放在室溫下，避免光線的條件下，反應(yīng)15 min;反應(yīng)后，在每孔中分別將終止液（50 μL）加入，搖勻，反應(yīng)終止;用酶標(biāo)儀30 min內(nèi)在450 nm下獲取OD值;橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上依據(jù)血清樣品的0D值查出其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所涉數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示（±s），全部計(jì)量資料均采用Student-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 空白對照組大鼠反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，毛色光潔。吸入OVA不久后，模型組及給藥大鼠立即出現(xiàn)躁動不安，搔抓顏面皮毛，呼吸急短，咳嗽時發(fā)、毛豎立，活動頻率驟然降低或俯臥靜止的現(xiàn)象。伴隨激發(fā)頻次增多，以上癥狀增多并加重，經(jīng)連續(xù)激發(fā)后毛發(fā)暗淡，遲鈍性反應(yīng)，呼吸頻率及呼吸幅度明顯紊亂。與模型組對照比較，止嗽散高、中、低劑量組癥狀減輕，但仍存在呼吸急促及呼吸困難癥狀。

2.2 止嗽散對CVA大鼠血常規(guī)的影響 造模后，模型組大鼠血常規(guī)淋巴細(xì)胞絕對值升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），嗜酸性粒細(xì)胞絕對值、中性粒細(xì)胞絕對值升高，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。止嗽散給藥治療后，高劑量組嗜酸性粒細(xì)胞絕對值、淋巴細(xì)胞絕對值下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），低劑量組中性粒細(xì)胞絕對值下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 止嗽散對CVA大鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4含量的影響 造模后，模型組大鼠血清及BALF中的IL-4含量增多，IFN-γ含量減少，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。止嗽散給藥治療后，高劑量組大鼠血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。止嗽散中劑量組的血清IL-4含量減少，較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2、表3。

2.4 止嗽散對CVA大鼠肺臟組織的影響 大鼠處死后，取其肺臟，10%福爾馬林固定。石蠟包埋切片，切片厚約4～5 μm，HE染色。根據(jù)病變輕重程度，依次半定量為輕度“+”，中度“++”，重度“+++”，無病變組織標(biāo)記為“—”?？瞻讓φ战M：本組8例，肺臟肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮完整，肺泡壁毛細(xì)血管無擴(kuò)張充血，腔內(nèi)無滲出物，間質(zhì)少量慢性炎細(xì)胞浸潤。模型組：本組8例肺臟多灶性炎性細(xì)胞浸潤（+-++），可見纖維結(jié)締組織輕度增生（+）。地塞米松組：本組8例肺臟，4例肺臟多灶性炎性細(xì)胞浸潤（+），4例肺臟可見纖維結(jié)締組織輕度增生（+）。止嗽散高劑量組：本組8例肺臟，5例肺臟可見多灶性炎性細(xì)胞浸潤（+），4例肺臟可見纖維結(jié)締組織輕度增生（+）。止嗽散中劑量組：本組8例肺臟，5例肺臟可見多灶性炎性細(xì)胞浸潤（+-++），7例肺臟可見纖維結(jié)締組織輕度增生（+）。止嗽散低劑量組：本組8例肺臟，7例肺臟可見多灶性炎性細(xì)胞浸潤（+-++），8例肺臟可見纖維結(jié)締組織輕度增生（+）。見圖1。

3 討論

現(xiàn)代研究顯示CVA與氣道高敏性、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)及環(huán)境、感染等因素有關(guān)[8-10]。其中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CVA的病生理改變都是以持續(xù)氣道慢性炎性反應(yīng)與氣道高反應(yīng)性（BHR）為本質(zhì)特征[11-12]，其次，現(xiàn)代研究表明，在相同環(huán)境下，不同個體患病風(fēng)險不同，而這種易感性差異取決于Th1輔助細(xì)胞與Th2輔助細(xì)胞之間的免疫平衡，是機(jī)體發(fā)病及持續(xù)存在疾病狀態(tài)的免疫學(xué)基礎(chǔ)。Th1輔助細(xì)胞具有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫功能，Th2輔助細(xì)胞具有誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的功能，因此，通過增強(qiáng)Th1型反應(yīng)，抑制Th2型反應(yīng)可有效改善哮喘治療效果[13-14]。Th1及Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子分別有IFN-γ、IL-4，在哮喘發(fā)病過程中CD4+T細(xì)胞的分化和功能從正性負(fù)性2方面均受其控制[15]。

CVA屬于中醫(yī)“咳嗽”的范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“五臟六腑皆令人咳，非獨(dú)肺也。然肺為氣之主，諸氣上逆于肺，則嗆而咳，是咳嗽不止于肺，而不離于肺”。中醫(yī)理論人認(rèn)為，肺為嬌臟，易受內(nèi)外之邪侵襲而為病，病則宣肅失常，肺氣上逆，發(fā)為咳嗽。治當(dāng)疏風(fēng)宣肺，理氣止咳。止嗽散是《醫(yī)學(xué)心悟》的名方之一，在CVA的治療方面得到廣泛應(yīng)用，具有辛溫解表，宣肺疏風(fēng)，止咳化痰之功效。溫潤和平，溫而不燥，潤而不膩，散寒不助熱，解表不傷正[16-18]。

本研究結(jié)果表明，止嗽散高劑量組大鼠血液中嗜酸性粒細(xì)胞絕對值、淋巴細(xì)胞絕對值降低，血清和BALF中IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。同時能夠改善肺臟組織炎性細(xì)胞浸潤，減輕纖維結(jié)締組織增生。結(jié)果提示止嗽散可以通過降低血清和BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫失衡，改善CVA癥狀。

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（2019-09-16收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473609）;江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目（YB2015070）

作者簡介：胡佳（1984.10—），女，博士研究生在讀，主治中醫(yī)師，研究方向：內(nèi)科疾病的中西醫(yī)診療，E-mail：12712648@qq.com

通信作者：沈波（1985.06—），男，碩士，主治中醫(yī)師，研究方向：內(nèi)科疾病的中西醫(yī)結(jié)合診療，E-mail：253951220@qq.com