下調(diào)JMJD2B表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

張敏 劉曉莉 張妮 雷蕾 孫超

[摘要]目的 探討組蛋白去甲基化酶JMJD2B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法 應(yīng)用JMJD2B siRNA和control siRNA轉(zhuǎn)染人正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞和卵巢癌SKOV3細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法分別檢測(cè)細(xì)胞中JMJD2B、環(huán)氧化酶2（COX2）mRNA和蛋白的表達(dá)水平。采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的增殖情況。選取20例卵巢癌病人的癌組織及癌旁正常組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)并比較兩種組織中JMJD2B和COX2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與IOSE80細(xì)胞比較，SKOV3細(xì)胞中JMJD2B、COX2的mRNA和蛋白水平均升高，差異有顯著性（t=13.74～19.34，P<0.05）。JMJD2B siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后可以顯著下調(diào)JMJD2B和COX2 mRNA的表達(dá)水平（t=4.97～7.56，P<0.05），細(xì)胞的克隆形成能力明顯降低;而高表達(dá)COX2可以部分恢復(fù)細(xì)胞的克隆形成能力（F=58.23，P<0.05）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制JMJD2B的表達(dá)可以明顯降低COX2的啟動(dòng)子活性（t=35.48，P<0.01）。人卵巢癌組織中JMJD2B和COX2的mRNA表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高（t=85.42、85.11，P<0.05），且二者呈正相關(guān)（R2=0.983，95%CI=0.984～0.995，P<0.01）。結(jié)論 降低JMJD2B水平可通過(guò)抑制COX2表達(dá)進(jìn)而抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤;組蛋白去甲基化酶;環(huán)氧化酶2;細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)]R73-354

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2021）02-0250-05

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of the histone demethylase JMJD2B on the proliferation of ovarian cancer cells and the related mechanism. ?Methods JMJD2B siRNA and control siRNA were transfected into normal human ovarian epithelial IOSE80 cells and ovarian cancer SKOV3 cells， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of JMJD2B and COX2 in these cells. Colony-forming assay was used to measure the proliferation of SKOV3 cells. Cancer tissue and normal adjacent tissue were collected from 20 patients with ovarian cancer， and quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of JMJD2B and COX2. ?Results Compared with IOSE80 cells， SKOV3 cells showed significant increases in the mRNA and protein expression levels of JMJD2B and COX2 （t=13.74-19.34，P<0.05）. After SKOV3 cells were transfected with JMJD2B siRNA， there were significant reductions in the mRNA expression levels of JMJD2B and COX2 （t=4.97-7.56，P<0.05） and colony-forming ability， while the high expression of COX2 partially restored the colony-forming ability （F=58.23，P<0.05）. The results of dual luciferase assay showed that the inhibition of JMJD2B expression significantly reduced the promoter activity of COX2 （t=35.48，P<0.01）. The mRNA expression levels of JMJD2B and COX2 in human ovarian cancer tissue were significantly higher than those in adjacent tissue （t=85.42，85.11;P<0.05）， with positive correlation between them （R2=0.983，95%CI=0.984 to 0.995，P<0.01）. ?Conclusion The reduction of JMJD2B can inhibit the proliferation of human ovarian cancer cells by inhibiting the expression of COX2.

[KEY WORDS]ovarian neoplasms; JMJD2B; cyclooxygenase 2; cell proliferation

JMJD2B是新近研究發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶，可調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)[1]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，JMJD2B在多種腫瘤如乳癌、胃癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，JMJID2B在卵巢癌組織中高表達(dá)，提示JMJD2B與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，JMJD2B介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)分子機(jī)制研究甚少。環(huán)氧化酶2（COX2）是一種促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移及抑制細(xì)胞凋亡的炎性細(xì)胞因子[6-9]。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX2的表達(dá)受表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)控，例如組蛋白修飾、DNA甲基化等[10-13]。還有研究發(fā)現(xiàn)，COX2的DNA甲基化與胃癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱異型細(xì)胞癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)，特別是COX2的高度甲基化預(yù)示腫瘤的不良預(yù)后[10，14-17]。本研究觀察抑制人卵巢癌細(xì)胞JMJD2B表達(dá)后COX2水平的變化，以及靶向抑制JMJD2B 表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，探討JMJD2B促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用及其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（購(gòu)自濟(jì)南市人民醫(yī)院），人正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE80（購(gòu)于中國(guó)上海慧穎生物科技有限公司）;胎牛血清、DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）;JMJD2B siRNA和control siRNA（Invitrogen公司，美國(guó)），JMJD2B siRNA序列為5′-UCUCCAUCACCUG-CCUCAAGCACAA-3′，control siRNA為5′-CCU-ACAUCCCGAUCGAUGAUGUUGA-3′;轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國(guó)）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific公司，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Takara公司，日本）;BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó)）;JMJD2B抗體（Bethyl Laboratories公司，美國(guó)），COX2抗體（Cayman chemical公司，美國(guó)），β-actin抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗（Jackson ImmunoResearch公司，美國(guó)）;ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（Millipore公司，美國(guó)），COX2高表達(dá)質(zhì)粒和COX2啟動(dòng)子質(zhì)粒（上海浩然生物技術(shù)有限公司）。卵巢癌病人手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本各20例（濟(jì)南市人民醫(yī)院）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞和IOSE80細(xì)胞分別在含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2 條件下傳代培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種至6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)60%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明，分別將JMJD2B siRNA、control siRNA或COX2高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞或者組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將所得cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。以cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶作用下行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。所用引物及其序列見表1。PCR反應(yīng)體系10 μL，內(nèi)含2×SYBR Green Mixture 5.0 μL，2.5 μmol/L正反向引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足體積至10.0 μL。PCR條件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，74 ℃、30 s，在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后收集熒光數(shù)據(jù)。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè) 應(yīng)用RIPA裂解細(xì)胞，在冰上靜置30 min，以12 000 r/min離心10 min，取蛋白上清檢測(cè)質(zhì)量濃度后，取40 μg上樣，在體積分?jǐn)?shù)0.10的SDS-PAGE中電泳分離（電壓50 V，時(shí)間250 min），電轉(zhuǎn)至PVDF膜（電流250 mA，時(shí)間190 min），以50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉60 min，加一抗（JMJD2B，1∶1 000稀釋;COX2，1∶100稀釋;β-actin，1∶1 000稀釋）4 ℃過(guò)夜孵育，PBST漂洗3次，每次5 min，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育60 min，PBST漂洗3次，每次5 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光工作液室溫孵育2～3 min，暗室中曝光、顯影、定影，掃描拍照后保存數(shù)據(jù)。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) SKOV3細(xì)胞接種至細(xì)胞板，將JMJD2B siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24 h后行COX2啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-TK作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，Passive Lysis Buffer裂解細(xì)胞。最后用熒光素酶報(bào)告基因分析儀檢測(cè)熒光素酶的活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x2±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用ANOVA分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IOSE80細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞中JMJD2B和COX2表達(dá)比較

SKOV3細(xì)胞中JMJD2B、COX2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于IOSE80細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.74～19.34，P<0.05）。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA對(duì)COX2表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和蛋白印跡法的檢測(cè)結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA后，JMJD2B和COX2的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，差異有顯著性（t=4.97～7.56，P<0.05）。見圖2。

2.3 抑制JMJD2B的表達(dá)對(duì)COX2啟動(dòng)子表達(dá)的影響

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制JMJD2B的表達(dá)可以明顯降低COX2的表達(dá)，差異有顯著性（t=35.48，P<0.01）。見圖3。

2.4 JMJD2B和COX2表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞克隆形成能力的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染JMJD2B siRNA后細(xì)胞的克隆形成能力明顯減弱，而高表達(dá)COX2可以部分恢復(fù)細(xì)胞的克隆形成能力（F=58.23，P<0.01）。見圖4。

2.5 人卵巢癌組織及其癌旁組織中JMJD2B和COX2 mRNA表達(dá)關(guān)系

與癌旁組織相比，卵巢癌組織中JMJD2B和COX2的mRNA表達(dá)均顯著升高（t=85.42，P<0.05），且兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（R2=0.983，95%CI=0.984～0.995，P<0.01）。見圖5。

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多步驟演進(jìn)的復(fù)雜病理過(guò)程，涉及信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常和基因表達(dá)調(diào)控異常，其中表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。表觀遺傳學(xué)調(diào)控主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化、染色體重塑和非編碼RNAs等，其中組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控機(jī)制[18-19]。組蛋白修飾主要有磷酸化/去磷酸化、甲基化/去甲基化、乙?；?去乙酰化等多種共價(jià)修飾作用[20]。組蛋白修飾的異常調(diào)節(jié)，改變了基因表達(dá)的特性，為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)[21-22]。組蛋白去甲基化酶JMJD2B是新近研究發(fā)現(xiàn)的JMJD2家族中的一員，主要靶向組蛋白H3第9位賴氨酸的三甲基（H3K9me3）使其發(fā)生去甲基化，在干細(xì)胞分化、炎癥和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的表觀遺傳學(xué)作用[2，23]。近期研究發(fā)現(xiàn)，JMJD2B主要定位于卵巢癌細(xì)胞株的細(xì)胞核內(nèi)，這可能與其調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路基因的表達(dá)有關(guān)[15]，但JMJD2B在促進(jìn)卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機(jī)制則尚未完全闡明。近期研究發(fā)現(xiàn)，COX2的表達(dá)受到表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白的修飾等[12-13，24]。COX2的DNA甲基化水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，尤其是COX2的高度甲基化預(yù)示著胃癌的不良預(yù)后[25]。有研究顯示，JMJD2B通過(guò)不同調(diào)控機(jī)制參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1，4]。

本實(shí)驗(yàn)探討JMJD2B是否通過(guò)調(diào)控COX2表達(dá)介導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果顯示，JMJD2B和COX2在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中表達(dá)均明顯高于人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80，JMJD2B和COX2在卵巢癌組織中的表達(dá)均顯著升高并呈正相關(guān);以RNA干擾技術(shù)靶向抑制人卵巢癌細(xì)胞JMJD2B表達(dá)后，COX2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯下調(diào)。提示COX2信號(hào)通路在人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的作用受組蛋白去甲基化酶JMJD2B調(diào)控。為進(jìn)一步研究JMJD2B在促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的分子機(jī)制，本文應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)探討JMJD2B表達(dá)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，靶向抑制JMJD2B的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，表明JMJD2B通過(guò)調(diào)控COX2表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。但是，本研究存在著局限性，即僅采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)抑制JMJD2B對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。今后需要進(jìn)一步對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力和細(xì)胞分裂周期等進(jìn)行研究，以探討卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制。此外，本文研究還顯示，降低JMJD2B表達(dá)水平可抑制卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力。

綜上所述，抑制JMJD2B表達(dá)可能通過(guò)阻斷COX2信號(hào)通路下調(diào)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制人卵巢癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步分析組蛋白去甲基化酶JMJD2B、COX2信號(hào)通路和腫瘤相關(guān)基因表達(dá)間的相互作用，將有助于深入了解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和組蛋白修飾在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的相互作用，為進(jìn)一步探討JMJD2B在卵巢腫瘤中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）