基因工程玉米Bt799對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞微團(tuán)及腭板發(fā)育的影響

侯超 郭倩穎 劉欣然 劉思奇 麻慧娟 劉珊 王軍波

基因工程技術(shù)應(yīng)用于新品種作物栽培已有近40年歷史，該技術(shù)為人類(lèi)應(yīng)對(duì)糧食短缺和農(nóng)作物病蟲(chóng)害提供了有效途徑[1]。1993年轉(zhuǎn)入Bt(Bacillus thuringiensis)基因的抗蟲(chóng)玉米研發(fā)問(wèn)世，抗蟲(chóng)玉米的應(yīng)用解決了玉米螟對(duì)作物的啃食問(wèn)題，減少了抗蟲(chóng)農(nóng)藥使用量，在保護(hù)環(huán)境和提高經(jīng)濟(jì)收益方面產(chǎn)生了積極影響[2]。然而，近年來(lái)，基因工程作物食用安全性問(wèn)題存在爭(zhēng)議[1-4]。對(duì)基因工程作物開(kāi)展研究可以考察其食用安全性，并為進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。歐洲替代方法驗(yàn)證中心(European Center for Validation of Alternative Methods, ECVAM)推薦的胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)為有效性較高的體外胚胎毒性發(fā)育試驗(yàn)[5]，腭板培養(yǎng)也是研究受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育影響和機(jī)理的主要手段[6]。因此，本研究通過(guò)大鼠中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)和腭板培養(yǎng)兩種方法，對(duì)基因工程玉米Bt799及目的蛋白Cry1Ac進(jìn)行了發(fā)育毒性研究，為基因工程作物食用安全性評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

材料與方法

一、受試物

Cry1Ac蛋白凍干粉(95%～98%)(Laboratory of Biochemistry Dept，School of Medicine, Case Western Reserve University)，基因工程玉米Bt799(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))。Bt799玉米轉(zhuǎn)入了Cry1Ac基因，各部位可穩(wěn)定表達(dá)Cry1Ac蛋白，種子中Cry1Ac蛋白表達(dá)量為(130.0±1.3)ng/g(n=3)。親本玉米鄭58種子中未檢測(cè)到Cry1Ac蛋白。兩種玉米主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 Bt799玉米和鄭58玉米主要營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比(mean±SD, n=3, g/100 g)

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康未生育雌性Wistar大鼠，9周齡，體重(200±20)g；SPF級(jí)健康未生育雄性Wistar大鼠，9周齡，體重(300±20)g。大鼠按雌雄比1∶1于18:00合籠并于次日8:00檢查陰栓，以查見(jiàn)陰栓之日為孕0 d。雌鼠全部受孕后，使用加工飼料按照分組喂養(yǎng)雄鼠并制備即刻離心血清(immediate centrifugation serum, ICS)，制備后使用ELISA試劑盒檢測(cè)ICS中Cry1Ac蛋白含量。雌鼠用于提取胚胎中腦細(xì)胞和胚胎腭板。實(shí)驗(yàn)用大鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK11-00-0004；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2006-0025；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0008)。飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施(SPF)合格證書(shū)：醫(yī)動(dòng)字第01-2055)。環(huán)境溫度范圍：(25±1)℃，相對(duì)濕度范圍：50%～60% RH，室內(nèi)照明：12 h:12 h明暗交替。單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

三、主要試劑

雙酚A(美國(guó)Sigma公司)，0.1%中性紅(美國(guó)Amresco公司)，蘇木精(美國(guó)Sigma公司)，全反式視黃酸(all-trans retinoic acid，ATRA)(美國(guó)Sigma公司)，BGjb標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(美國(guó)Hyclone公司)，Bt-Cry1Ac-ELISA試劑盒(美國(guó)Agdia公司)。

四、主要儀器

恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置(金壇區(qū)金城致杰實(shí)驗(yàn)儀器廠)，混合供氣系統(tǒng)(雷蒙特科學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，體視顯微鏡(北京西沖科技發(fā)展有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)。

五、中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.中腦細(xì)胞提取方法：于孕13 d時(shí)脫頸處死孕鼠并消毒，無(wú)菌艙中剖腹取出子宮分離胚胎。體視顯微鏡下選擇處于34～36體節(jié)數(shù)時(shí)期的胚胎，分離胚胎中腦組織，將中腦組織于37 ℃下以PBS沖洗三次后孵育20 min，棄去PBS以適量0.5%胰蛋白酶消化10 min。加入Ham′s F12完全培養(yǎng)液終止消化并連續(xù)沖洗三次。于適量Ham′s F12培養(yǎng)液中吹吸打散組織塊，200目篩過(guò)濾得到單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)細(xì)胞，將所提取細(xì)胞的細(xì)胞密度調(diào)整到5×109/L，接種于24孔板或96孔板中，分別進(jìn)行細(xì)胞分化與增殖觀察。

2.實(shí)驗(yàn)分組與劑量設(shè)計(jì)：中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)分八個(gè)組進(jìn)行，分別對(duì)應(yīng)表2中描述的八種不同培養(yǎng)環(huán)境。將制備ICS的Wistar大鼠隨機(jī)分為六組，其中NM(Naturel Parent:親本對(duì)照)組、TM3(Time 3 Days:干預(yù)3天)組、TM1M(Time 1 Month:干預(yù)1個(gè)月)組、TM3M(Time 3 Days:干預(yù)3個(gè)月)組、PCB(Positive Control B:陽(yáng)性對(duì)照B)組為前五組大鼠，BP(Bt Protein:Bt蛋白組)組、BC(Black Control:空白對(duì)照組)組、PCA(Positive Control A:陽(yáng)性對(duì)照A)組因大鼠未經(jīng)直接干預(yù)且不影響組間比較，故共同使用第六組大鼠的血清。在上述分組中NM組、TM3組、TM1M組、TM3M組使用添加玉米樣本的加工飼料。以玉米所含淀粉完全替代AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料中碳水化合物，由此計(jì)算出玉米最大可添加量為84.7%。飼料制作確保主要營(yíng)養(yǎng)成分構(gòu)成不變，蛋白質(zhì)不足部分以酪蛋白補(bǔ)充。BP組Cry1Ac蛋白的添加量為依照飼料中玉米添加量、Bt799玉米種子中Cry1Ac蛋白含量、大鼠飼料攝入量計(jì)算所得的最大可能暴露劑量。于雌鼠孕13 d獲得胚胎中腦細(xì)胞，不同條件下進(jìn)行細(xì)胞增殖和分化觀察，分組與干預(yù)方式如表2。

3.蘇木精染色法觀察中腦細(xì)胞分化情況：吸取20 μL細(xì)胞懸液加入24孔板，按照表2中分組描述進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)劑量組設(shè)10個(gè)平行樣。細(xì)胞于37 ℃條件下貼壁2 h。CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)中腦細(xì)胞5 d，然后吸去培養(yǎng)基，10%甲醛固定20 min，棄甲醛并以蘇木精染色1～3 min，去離子水洗去染液靜置返藍(lán)15 min后風(fēng)干。顯微鏡下計(jì)數(shù)著色集落，根據(jù)中腦細(xì)胞集落數(shù)量確定細(xì)胞分化情況。集落分化百分比(%)=實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)/溶劑對(duì)照組集落數(shù)×100%。

4.中性紅攝取法觀察中腦細(xì)胞增殖情況：吸取10 μL細(xì)胞懸液加入96孔板，按照表2中分組描述進(jìn)行干預(yù)，每個(gè)劑量組設(shè)10個(gè)平行樣。細(xì)胞于37 ℃條件下貼壁2 h。CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)中腦細(xì)胞5 d。棄去培養(yǎng)基，于戊二醛中固定中腦細(xì)胞20 min，隨后以生理鹽水清洗三次。于0.05%中性紅溶液中室溫孵育30 min，棄去中性紅并以生理鹽水清洗三次，再以50%甲醛提取2 h。使用分光光度計(jì)于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值(A)，并根據(jù)吸光度值判斷細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A溶劑對(duì)照組×100%。

表2 大鼠胚胎中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)分組與干預(yù)方式

六、腭板培養(yǎng)方法

1.腭板的體外旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：孕12.5 d(以妊娠第12.5 d的14:00為準(zhǔn))時(shí)脫頸處死雌鼠并消毒，于無(wú)菌艙中分離胚胎，以眼科剪將胚胎順口凹與眼水平線剪下顱面中部。以解剖刀沿腭板下沿水平切去后腦組織、舌頭及下腭，保留腭板。將9 mL的BGjb培養(yǎng)液(37 ℃預(yù)溫)加入50 mL培養(yǎng)瓶中并向培養(yǎng)液中加入對(duì)應(yīng)受試物，用吸管將腭板轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)密度每瓶3～4個(gè)。于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中以不同分組條件連續(xù)培養(yǎng)腭板72 h(37 ℃，25 r/min)。分別于培養(yǎng)第0 h、24 h、48 h向培養(yǎng)瓶充入無(wú)菌過(guò)濾混合氣體2.5 min，混合氣體體積比為50:5:45(O2:CO2:N2)。

2.實(shí)驗(yàn)分組：于恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中依照表3進(jìn)行72 h腭板連續(xù)培養(yǎng)。分組與干預(yù)如表3。

表3 大鼠胚胎腭板旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)分組與干預(yù)方式

3.腭板培養(yǎng)評(píng)分：腭板融合情況分5個(gè)類(lèi)型，即(1)雙側(cè)腭突仍分離計(jì)為1分；(2)雙側(cè)腭突靠近但未接觸計(jì)為2分；(3)雙側(cè)腭突接觸但未融合計(jì)為3分；(4)雙側(cè)腭突部分融合(后部軟腭融合)計(jì)為4分；(5)雙側(cè)腭突完全融合(融合長(zhǎng)度>1/2中線長(zhǎng)度)計(jì)為5分。每只腭板根據(jù)上述分類(lèi)情況計(jì)分，并計(jì)算融合率(融合率=計(jì)分為4分和5分的腭板數(shù)/總腭板數(shù))。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)組間比較使用單因素方差分析、Tukey′s事后兩兩比較檢驗(yàn)；方差不齊數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)，并用Dunnett ′s進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Cry1Ac蛋白及不同ICS對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞增殖分化的影響

如表4所示，TM3組、TM1M組、TM3M組和BP組中腦細(xì)胞增殖率略低于BC組和NM組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TM3M組細(xì)胞分化率低于BC組和NM組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各組細(xì)胞分化率均未同時(shí)低于BC組和NM組。PCA組和PCB組細(xì)胞增殖與集落分化率都明顯減少，與NM組、BC組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TM3組、TM1M組、TM3M組、BP組之間細(xì)胞增殖率和細(xì)胞分化率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 Cry1Ac蛋白、雙酚A和不同ICS對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞增殖與分化的影響(mean±SD, n=10)

二、Cry1Ac蛋白對(duì)大鼠胚胎腭板形態(tài)的影響

如圖1-A和圖1-B所示，BC組和BP組多數(shù)腭板正常融合；如圖1-C所示，RA組可見(jiàn)較多雙側(cè)腭突未接觸的腭板。如表5所示，BP組腭板融合率與BC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RA組腭板融合率與BC組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:Fused palate of BP group; B:Fused palate of BC group; C:Palatal plate without fusion of RA group

表5 Cry1Ac蛋白與全反式視黃酸對(duì)Wistar大鼠胚胎腭板融合率的影響

三、大鼠血清中Cry1Ac蛋白的含量

按照分組使用加工飼料分別喂養(yǎng)大鼠3 d、1個(gè)月、3個(gè)月后，所制備ICS中Cry1Ac蛋白含量接近，TM3、TM1M、TM3M組間結(jié)果兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MN、BC組大鼠ICS中未檢出Cry1Ac蛋白(檢測(cè)限>0.01μg/L)。TM3、TM1M、TM3M組結(jié)果與BC、NM組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 Bt799玉米喂養(yǎng)不同時(shí)間后各組大鼠ICS中Cry1Ac蛋白含量(mean±SD, n=8)

討 論

本研究通過(guò)微團(tuán)培養(yǎng)和腭板培養(yǎng)兩種方法，參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)(GB 15193.25-2014)對(duì)基因工程玉米Bt799及其目的蛋白Cry1Ac進(jìn)行了發(fā)育毒性研究。為了判斷飼喂Bt799玉米是否會(huì)導(dǎo)致大鼠血清中出現(xiàn)Cry1Ac蛋白，并研究血清中存在Cry1Ac蛋白情況下可能帶來(lái)的進(jìn)一步影響，本研究在微團(tuán)培養(yǎng)中采用經(jīng)Bt799玉米喂養(yǎng)大鼠的ICS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與此同時(shí)設(shè)立BP組，使用Cry1Ac蛋白對(duì)胚胎中腦細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)兩種暴露途徑共同探究了基因工程玉米Bt799及Cry1Ac蛋白發(fā)育毒性的可能性。本研究結(jié)果顯示，TM3組和BP組細(xì)胞增殖率都與BC組和NM組有細(xì)微差異，而TM3組血清是存在Cry1Ac蛋白的，提示Cry1Ac蛋白可能對(duì)中腦細(xì)胞增殖產(chǎn)生了輕微影響。但因整體食物與食物中主要成分無(wú)法等價(jià)，食物中特定物質(zhì)的影響也不能代表整體食物的影響，故存在Bt799玉米本身對(duì)中腦細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響的可能性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bt799玉米與已具備足夠安全性的親本對(duì)照鄭58玉米相比不具備更高危險(xiǎn)性；此外BP組與BC組相比細(xì)胞增殖率、分化率無(wú)明顯差異，表明Cry1Ac蛋白未產(chǎn)生不良影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了Bt799玉米的安全性。已有研究證實(shí)雙酚A具有發(fā)育毒性[7]，其可能機(jī)制是通過(guò)影響Notch-Hes通路，增加了Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)水平[8]。李勇等[6]研究發(fā)現(xiàn)雙酚A為陽(yáng)性致畸物，在40 mg/L的暴露劑量下對(duì)中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)存在不良影響。本研究發(fā)現(xiàn)PCA組細(xì)胞增殖率與分化率明顯低于BC組，這與既往研究結(jié)果一致，并與TM3組的結(jié)果形成陽(yáng)性對(duì)照，表明Bt799玉米與雙酚A相比安全性較高。PCB組細(xì)胞增殖率與分化率明顯低于BC組，這與既往研究結(jié)果一致，并與BP組的結(jié)果形成陽(yáng)性對(duì)照，表明Cry1Ac蛋白與雙酚A相比安全性較高。但考慮到雙酚A的化學(xué)結(jié)構(gòu)與Cry1Ac蛋白相比差距較大。建議在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步以蛋白質(zhì)類(lèi)致畸物作為陽(yáng)性對(duì)照，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

以上研究結(jié)果表明在最大可添加劑量下，Bt799玉米和Cry1Ac蛋白均不會(huì)對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞的增殖與分化產(chǎn)生影響。Flint[9]認(rèn)為受試物的半數(shù)分化抑制濃度在10 μg/mL以下時(shí)為強(qiáng)致畸物，在100 μg/mL以上時(shí)無(wú)致畸作用。本研究中Cry1Ac蛋白添加劑量為5.2 mg/L，此劑量下Cry1Ac蛋白未對(duì)大鼠中腦細(xì)胞增殖與分化產(chǎn)生影響。在后續(xù)研究中應(yīng)設(shè)置更高劑量梯度，計(jì)算Cry1Ac蛋白的半數(shù)分化抑制濃度和半數(shù)增殖抑制濃度，從而判定Cry1Ac蛋白的致畸性。從實(shí)際暴露的角度出發(fā)，Cry1Ac蛋白的唯一暴露途徑為通過(guò)基因工程作物經(jīng)口攝入，暴露水平不會(huì)高于5.2 mg/L，與此同時(shí)Cry1Ac蛋白檢測(cè)結(jié)果提示喂養(yǎng)不同時(shí)長(zhǎng)后大鼠ICS中Cry1Ac蛋白含量無(wú)明顯差異，提示Cry1Ac蛋白未表現(xiàn)出蓄積性，進(jìn)一步說(shuō)明不存在暴露水平高于5.2 mg/L的可能性。因此，探索Cry1Ac蛋白的半數(shù)分化抑制濃度和半數(shù)增殖抑制濃度僅可作為Cry1Ac蛋白研究的補(bǔ)充，但不具備較高食品安全評(píng)價(jià)價(jià)值。TM3組、TM1M組、TM3M組細(xì)胞增殖率、分化率與BC組、NM相比均無(wú)明顯差異，表明在最大可添加量下，飼喂Bt799玉米三個(gè)月不會(huì)對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)生不良影響，喂養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不是可能導(dǎo)致不良結(jié)果的主要因素。本研究里ICS中Cry1Ac蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，使用含Bt799玉米的加工飼料喂養(yǎng)大鼠可導(dǎo)致Cry1Ac蛋白在血清中的存在，這提示親代大鼠攝入Bt799玉米后，其胎仔存在暴露于Cry1Ac蛋白的可能性；但血清中可檢測(cè)到Cry1Ac蛋白的具體原因尚不明確，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。與此同時(shí)，本次研究所用ICS均來(lái)自雄鼠，所測(cè)結(jié)果可能與雌鼠羊水中Cry1Ac濃度存在差異，建議在后續(xù)研究中，同時(shí)檢測(cè)雌鼠孕期血清與羊水中Cry1Ac蛋白濃度，明確該蛋白通過(guò)胎盤(pán)屏障的可能性。大鼠胎仔生物結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育完全，血腦屏障是否能阻斷Cry1Ac蛋白的通過(guò)存在不確定性，故在后續(xù)研究中建議檢測(cè)大鼠胎仔大腦中Cry1Ac蛋白含量，判斷該蛋白通過(guò)血腦屏障的可能性。

腭板培養(yǎng)是判斷物質(zhì)致畸性的常用方法[10]。Shiota等[11]認(rèn)為血清中含有不確定物質(zhì)，不利于體外環(huán)境的控制。本研究采用無(wú)血清的標(biāo)準(zhǔn)BGjb培養(yǎng)液作為腭板培養(yǎng)基，排除了血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。本研究結(jié)果顯示，RA組腭板融合率顯著低于BC組，表明ATRA在本研究所用劑量下會(huì)顯著影響腭板融合，這與Han等[12]的研究結(jié)果一致。并與BP組形成陽(yáng)性對(duì)照，表明在最大可能暴露劑量下，Cry1Ac蛋白對(duì)大鼠腭板融合無(wú)不良影響。

本研究結(jié)果表明，在最大可能暴露劑量下，Bt799玉米和目的蛋白Cry1Ac均不具備發(fā)育毒性。Guo等[13]使用Bt799玉米喂養(yǎng)雄性大鼠13周，未發(fā)現(xiàn)該玉米對(duì)大鼠健康狀況和生殖系統(tǒng)的不良影響。Hu等[14]使用可表達(dá)Cry1Ac蛋白的基因工程大米對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)三代的喂養(yǎng)，除觀察到一些血液學(xué)指標(biāo)變化外未觀察到其他不良改變。總體而言，Bt799玉米是安全的。對(duì)Cry1Ac蛋白的安全性研究可作為基因工程作物食用安全性的證據(jù)[15]，但目前Cry1Ac蛋白的安全性尚無(wú)定論。Santos-Vigil等[16]通過(guò)灌胃Cry1Ac蛋白的方式對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有腸道致敏性。Torres-Martínez等[17]研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ac蛋白可影響大鼠巨噬細(xì)胞的活動(dòng)，通過(guò)NAPK和NF-κB途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化。所以圍繞Cry1Ac蛋白的研究依然具有實(shí)際價(jià)值。但受毒理學(xué)資料不足以及最大可添加劑量的限制，目前只能在一定限度內(nèi)說(shuō)明Cry1Ac蛋白對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的安全性，而對(duì)Cry1Ac蛋白是否屬于致畸物這一問(wèn)題的判斷需要毒理學(xué)研究的補(bǔ)充。

國(guó)內(nèi)目前對(duì)基因工程作物的態(tài)度為應(yīng)以實(shí)質(zhì)等同性原則為基礎(chǔ)并綜合采納其他方法開(kāi)展研究，其中也包括危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)和個(gè)案處理原則[18]。本研究使用體外實(shí)驗(yàn)替代了整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，一方面降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害，另一方面在體外獲得了更加直觀的結(jié)果。同時(shí)也從新的角度針對(duì)基因工程作物展開(kāi)了研究，為后續(xù)研究提供了新的數(shù)據(jù)與方法參考。此外，目前國(guó)內(nèi)外圍繞基因工程作物的研究多為整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體外研究較少且評(píng)價(jià)方法單一，分子水平研究的報(bào)道較少[19]。因此，后續(xù)應(yīng)在目前研究的基礎(chǔ)上，更加深入地探討基因工程作物的安全性，最大限度保證基因工程作物在實(shí)際應(yīng)用中的安全性。

綜上所述，本研究未觀察到Bt799玉米及其表達(dá)蛋白Cry1Ac對(duì)大鼠胚胎中腦細(xì)胞和腭板發(fā)育的不良影響。