母體游離胎兒DNA檢測在篩查胎兒新發(fā)突變或父源遺傳疾病的應(yīng)用

馮琳懿

明確胚胎發(fā)育中基因突變及突變來源情況，不僅利于在遺傳學(xué)因素中查找線索，防止缺陷新生兒的出生，也可為再次妊娠采取針對性措施提供幫助。然而目前傳統(tǒng)產(chǎn)前檢測方法，如絨毛活檢、羊膜腔穿刺術(shù)等取材進(jìn)行DNA檢查，對于孕婦和胎兒均具有一定的損傷，其導(dǎo)致的流產(chǎn)率可達(dá)0.5%～1%[1]，故尋求穩(wěn)定可靠的無創(chuàng)傷產(chǎn)前基因突變檢測方法是國內(nèi)外研究熱點之一。上世紀(jì)末，Khalil等[2]發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在微量游離胎兒DNA，這為無創(chuàng)傷產(chǎn)前基因突變檢測帶來了希望。但研究顯示，母體外周血中的游離胎兒DNA多在0.3 kb以下，游離胎兒DNA含量較低帶來的檢測靈敏度低的缺點限制了其在臨床上的應(yīng)用[3]。高通量基因測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)是基因檢測的新技術(shù)，文獻(xiàn)報道顯示，NGS技術(shù)輔助以DNA片段化處理技術(shù)在基因染色體異常片段測序及長度測量中具有較高的靈敏度和特異度(均可達(dá)到95%以上)[4]，這給母體游離胎兒DNA檢測帶來了技術(shù)保障。軟骨發(fā)育不全和致死性侏儒癥均是胚胎發(fā)育中基因突變后的常見骨骼疾病，年發(fā)病率分別約在3.6～6.4和2.1～5.1，60%以上常見骨骼疾病多因纖維細(xì)胞生長因子受體基因突變所產(chǎn)生，且這種基因突變具有典型父源遺傳性[5]。鑒于此，本研究以山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科近期收治的軟骨發(fā)育不全和致死性侏儒癥診斷的孕婦為研究對象，采用NGS技術(shù)聯(lián)合DNA片段化處理技術(shù)對母體游離胎兒DNA進(jìn)行基因突變檢測，并觀察其在篩查胎兒新發(fā)突變或父源遺傳疾病中的應(yīng)用可行性。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年1月—12月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的27例孕婦，其孕30～32周超聲提示或既往胎生史為軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥。孕婦年齡在20～35歲，平均年齡(28.7±2.5)歲。其中超聲提示或既往胎生史為軟骨發(fā)育不良癥就診孕婦19例，致死性侏儒癥就診8例。納入研究的孕婦及配偶身體健康，自身無軟骨發(fā)育不良癥或致死性侏儒癥，無妊娠期高血壓、糖尿病、脂肪肝等妊娠期合并癥或并發(fā)癥，肝腎功能正常，無婦科疾病。本研究所有孕婦及家屬對研究知情且簽訂同意書。

二、方法

1.檢測方法：27例孕婦均于孕30～32周在超聲引導(dǎo)下羊膜穿刺采集羊水2 mL和外周血20 mL，送實驗室分別進(jìn)行基因組DNA Sanger檢測和游離胎兒DNA突變檢測。(1)基因組DNA Sanger檢測。采用DNA Mini Kit試劑盒(美國公司ABI公司生產(chǎn))提取胎兒基因組DNA，采用Sanger測序法行軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥常見突變位點(c.1123、c.1138、c.1130)檢測[6]，以此基因組DNA Sanger測序檢測結(jié)果作為本研究金標(biāo)準(zhǔn)。(2)游離胎兒DNA突變檢測。首先進(jìn)行母體游離胎兒DNA提取，標(biāo)本順序ID編號(000-027)，離心血漿(1 600 ram/min, 4 ℃，10 min)，取上清2 mL轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，采用DNA Nucleic Acid Kit試劑盒(美國公司ABI公司生產(chǎn))提取母體游離胎兒DNA。(3)游離胎兒DNA片段化處理。采用共聚焦超聲波儀器(型號：Covaris E210；生產(chǎn)商：澳大利亞Ccorbett全司)對游離胎兒DNA進(jìn)行片段化處理，目標(biāo)片段跨度150～200 bp，以PCR Clean-Up磁珠碎片化并提純，40 μL緩沖液回溶，采用Bioanalyzer 2100 生物分析儀(生產(chǎn)商：北京東勝創(chuàng)新生物科技)對游離胎兒DNA 片段進(jìn)行長度測定。(4)熒光定量游離胎兒DNA濃度。采用Qubit? 2.0 熒光定量儀(生產(chǎn)商：北京天根生化科技)對游離胎兒DNA進(jìn)行濃度定量，對應(yīng)濃度按照10%、6%、3%、1%和0.5%標(biāo)準(zhǔn)，采用高通量染色體測序(NGS)技術(shù)對各濃度熒光定量游離胎兒DNA片段進(jìn)行測序，以100 bp為最低基因序列片段測試長度，通過測序以對位點基因片段進(jìn)行拍照。測序序列結(jié)果以文件形式保存以供評估。

2.評估標(biāo)準(zhǔn)：(1)片段化產(chǎn)物測序分析。將NGS測序序列結(jié)果與人類基因圖譜進(jìn)行對比，如DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫，獲取母體游離胎兒DNA片段化產(chǎn)物測序診斷結(jié)果。DGV數(shù)據(jù)庫軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥波峰分布132.5～158 bp之間[7]。(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)分析。NGS測序測序完成后，對測序序列進(jìn)行質(zhì)控，即去掉小于100 bp的序列后生產(chǎn)樣本問卷，使用mtools軟件進(jìn)行sort模塊排序，得到對應(yīng)濃度樣本波形圖獲取縱軸熒光OD值。DGV數(shù)據(jù)庫軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的DNA片段的Proton標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間為200～300 bp[8]。(3)NGS測序突變及突變來源分析。仔細(xì)觀察突變區(qū)域，對比DGV數(shù)據(jù)庫軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥基因序列片段，得出突變區(qū)域和類型。使用iTools軟件的Xamtools對基因突變片段進(jìn)行統(tǒng)計，得出對比區(qū)域位點堿基深度，提取各濃度樣本單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點堿基深度，取最大深度和次大深度，計算樣品MAF值，當(dāng)MAF<0.1%時，為純合位點，基因突變來源為父親基因，當(dāng)MAF>0.1%，為位點基于雜合突變，基因突變來源為胎兒。

結(jié) 果

一、27例母體游離胎兒DNA片段化產(chǎn)物測序分析

27例母體游離胎兒DNA(濃度3%)片段化產(chǎn)物集中在143.5 bp區(qū)域，區(qū)域跨度在132.5～158 bp之間，與生理條件下軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的DNA片段的波峰分布特征吻合。典型病例DNA片段化產(chǎn)物波峰分布見圖1。

Note:The horizontal "Fragment length" indicates the length of DNA fragment in unit bp, while the vertical "Fluorescence unit" indicates the fluorescence OD value.

二、27例母體游離胎兒DNA文件質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)評價

見圖2，母體游離胎兒DNA濃度分別為10%、6%、3%、1 %和0.5%時的片段化產(chǎn)物波峰分別為264 bp、263 bp、262 bp、261 bp、272 bp，主要分布于260～272 bp，屬于DGV數(shù)據(jù)庫DNA片段區(qū)間200～300 bp的標(biāo)準(zhǔn)，符合DNA文件質(zhì)控水平符合Proton質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

Note:The horizontal "Fragment length" indicates the length of DNA fragment in unit bp, while the vertical "Fluorescence unit" indicates the fluorescence OD value.

三、27例母體游離胎兒DNA的NGS測序突變及突變來源分析

如表1所示。母體游離胎兒DNA濃度分別為10%、6%、3%時，NGS測序共檢出6例基因突變，其中軟骨發(fā)育不良癥4例，致死性侏儒癥2例，檢測結(jié)果與基因組DNA Sanger測序突變結(jié)果吻合；母體游離胎兒DNA濃度為1%時，NGS測序共檢出3例基因突變，其中軟骨發(fā)育不良癥2例，致死性侏儒癥1例；母體游離胎兒DNA濃度為0.5 %時，NGS測序共檢出1例基因突變，為軟骨發(fā)育不良癥。4例軟骨發(fā)育不良癥樣本中，在c.1138位點基因突變峰明顯高于其他位點(母體游離胎兒DNA濃度為10%、6%、3%和1%時)，即胎兒攜帶c.1138>A突變基因，突變來源于胎兒，典型病例堿基變異分布見圖3(孕婦王某，28周歲，孕周31周，因既往胎兒軟骨發(fā)育不良癥生育史就診檢查)。2致死性侏儒癥樣本c.1138(Chr4 1806119)位點的突變峰變化<0.1%，致死性侏儒癥基因突變來源為父親基因。

表1 27例母體游離胎兒DNA的NGS測序突變及突變來源分析

Note:The longitudinal "SNP Percentage" indicates the proportion of variation at different concentrations of a site, while the transverse"SNP position" is the detection site.

討 論

軟骨發(fā)育不良胎兒在孕11～18周時采用超聲檢查多無異常，大多數(shù)在孕中晚期超聲檢查時才能發(fā)現(xiàn)胚胎骨骼生長速度明確滯后，故本研究將采血時間定為30～32孕周[9]。另外，致死性侏儒癥雖然能在孕中期影像學(xué)檢查中出現(xiàn)異常，如胸廓狹窄、四肢短小等，但由于各胎兒母體內(nèi)致死性侏儒癥異常表現(xiàn)特征并無特異性編制，因此僅以影像學(xué)檢查難以鑒別診斷[10]。本研究通過對孕婦外周血微量游離胎兒DNA進(jìn)行基因片段化處理后，采用熒光定量游離胎兒DNA濃度，然后運(yùn)用NGS無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)，初步探討母體游離胎兒DNA檢測在篩查胎兒骨骼疾病新發(fā)突變或父源遺傳疾病的可行性。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)游離胎兒DNA定量濃度高于3%時，NGS無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)可以準(zhǔn)確的對胎兒骨骼疾病的突變基因進(jìn)行檢測，與基因組DNA Sanger測序法的突變檢查結(jié)果吻合。由此提示，母體游離胎兒DNA檢測可用于胎兒骨骼疾病新發(fā)突變的檢測，這已得到文獻(xiàn)研究[11]的證實。

致死性侏儒癥、軟骨發(fā)育不良癥等骨骼疾病的顯著特征是父源效應(yīng)，即致病基因突變幾乎均來自于父方隱性基因[12]。研究顯示，當(dāng)父方年齡高于35周歲時，父方攜帶骨骼疾病隱基因，如c.1123、c.1138、c.1130位點的成骨纖維因子突變基因，其生育后代骨骼疾病風(fēng)險增加，與25歲以下相比，父親35周歲時，后代軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的風(fēng)險分別增加2.8倍和3.4倍[13]。隨著國內(nèi)二胎政策全面放開，高齡人群生育意愿有所增加，因此，相關(guān)遺傳疾病產(chǎn)前檢查顯得意義重大。本研究顯示，4例軟骨發(fā)育不良癥樣本中，在c.1138位點基因突變峰明顯高于其他位點(母體游離胎兒DNA濃度為10%、6%、3%和1%時)，即胎兒攜帶c.1138>A突變基因，突變來源于胎兒。而Li等[14]大樣本研究顯示軟骨發(fā)育不良癥基因突變源也可來源于父親方，研究中87例軟骨發(fā)育不良癥活生兒中，31例基因突變來源于父親方，占比高達(dá)35.6%。與本研究結(jié)果有一定的差異，可能原因在于本研究樣本量相對較小。另外，本研究結(jié)果還顯示，2例致死性侏儒癥樣本在c.1138(Chr4 1806119)位點的突變峰變化<0.1%，故致死性侏儒癥基因突變來源為父親基因。致死性侏儒癥有兩種類型，即致死性侏儒癥1型和致死性侏儒癥2型，前者胎兒影像學(xué)表現(xiàn)為長骨短而彎曲，后者胎兒影像學(xué)則表現(xiàn)為長骨短而直，尤其是后者大都是由父親方c.1138(Chr4 1806119)位點基因突變所至[15-16]。

綜上所述，可將母體游離胎兒DNA檢測應(yīng)用于其他遺傳性疾病胎兒的基因突變檢測，但需注意以下幾點：(1)由于游離胎兒DNA在母體中屬于微量(約在0.3 kb以下)，故需進(jìn)行熒光定量游離胎兒DNA濃度，以便于精確處理[17]；(2)多數(shù)實驗室將游離胎兒DNA濃度下限設(shè)定在5%或10%[18-19]，而將母體游離胎兒DNA濃度設(shè)定在3%時，可盡早查出胎兒基因突變，這具有重要的意義；(3)以母體游離胎兒DNA為檢測對象，必須明確致病基因片段分布特點，使母體游離胎兒DNA片段分布盡可能接近致病基因DNA片段分布規(guī)律[20]；(4)在病例納入中，必須排除盡可能多的影響因素。如軟骨發(fā)育不良癥、致死性侏儒癥，妊娠期高血壓、糖尿病、脂肪肝等，才可保障母體背景不受干擾。

綜上所述，雖然本研究樣本量較少，但仍然以真實樣本進(jìn)行試驗驗證，初步證實了母體游離胎兒DNA檢測在篩查胎兒新發(fā)突變或父源遺傳疾病中的應(yīng)用可行性。即當(dāng)游離胎兒DNA濃度≥3% 時，母體游離胎兒DNA檢測在篩查胎兒新發(fā)軟骨發(fā)育不良癥和致死性侏儒癥的基因突變或父源遺傳性中具有較高的質(zhì)控水平和準(zhǔn)確性，以此可類推到其他類型新發(fā)突變或父源遺傳疾病的產(chǎn)前診斷，表明母體游離胎兒DNA檢測在單基因遺傳疾病產(chǎn)前診斷中具有較好的應(yīng)用前景。