pNF-H、MMP-9聯(lián)合aEEG對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷的早期預(yù)測(cè)價(jià)值

趙瑩 徐艷 吳銘 袁文杰 王軍

隨著產(chǎn)科和新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的發(fā)展，早產(chǎn)兒的存活率明顯提高，但早產(chǎn)兒腦損傷(brain injury in premature infants，BIPI)的發(fā)生率也隨之增加[1]。早產(chǎn)兒腦損傷目前尚無(wú)有效的特異治療，目前重點(diǎn)在積極預(yù)防，如不能早期發(fā)現(xiàn)及干預(yù)，?？梢鹉X性癱瘓、智力低下，甚至死亡。有研究表明,神經(jīng)絲蛋白H磷酸化亞型(phosphorylated neurofilament heavy subunit，pNF-H)水平變化與神經(jīng)軸突損傷有關(guān),可反映神經(jīng)損傷和再生程度[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)是一類(lèi)肽鍵內(nèi)切酶，能降解大部分的細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血腦屏障，增加腦水腫、細(xì)胞凋亡等病理反應(yīng)[3]。近年來(lái)，振幅整合腦電圖(amplitude integrated EEG，aEEG)在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)得到越來(lái)越廣泛地應(yīng)用，aEEG可以通過(guò)檢測(cè)大腦皮層的電活動(dòng)來(lái)評(píng)估腦功能，這對(duì)新生兒窒息的治療和腦損傷的預(yù)后有重要價(jià)值[4]。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)早產(chǎn)兒血漿中pNF-H及MMP-9水平，并聯(lián)合aEEG檢測(cè)技術(shù)，探討其對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

1.納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：選擇2018年9月至2019年12月收入徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的具有高風(fēng)險(xiǎn)腦損傷的早產(chǎn)兒為研究對(duì)象，進(jìn)行前瞻性的隊(duì)列研究。研究開(kāi)始時(shí)入選74例早產(chǎn)兒，排除其中死亡4例、放棄治療 5 例、失訪 9 例，剩余56例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生胎齡為<37周，男女不限；(2)存在腦損傷高風(fēng)險(xiǎn)因素，包括以下其中之一：①新生兒生后存在中樞性呼吸暫?；蛞种茽顟B(tài)、心動(dòng)過(guò)緩、血壓波動(dòng)、意識(shí)改變、驚厥、顱內(nèi)壓增高、肌張力異常、原始反射異常等臨床表現(xiàn)；②新生兒具有腦缺氧缺血與血流動(dòng)力學(xué)紊亂情況，包括嚴(yán)重宮內(nèi)窘迫與出生時(shí)窒息、高或低碳酸血癥等；③新生兒有感染與炎癥反應(yīng)，包括絨毛膜羊膜炎、宮內(nèi)感染、壞死性小腸結(jié)腸炎等；④ 新生兒具有血液系統(tǒng)疾病表現(xiàn)，包括出凝血異常、中-重度貧血、紅細(xì)胞增多癥等；⑤孕母具有產(chǎn)科高危因素，包括血栓或羊水栓塞、孕母合并癥/并發(fā)癥、不良嗜好和異常分娩史等[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：由遺傳代謝紊亂、重度高膽紅素血癥、TORCH、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等引起的腦損害，以及有明顯染色體疾病和先天畸形患兒。本研究征得患兒家長(zhǎng)知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

2.早產(chǎn)兒腦損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2012版《中國(guó)當(dāng)代兒科雜志》的《早產(chǎn)兒腦損傷診斷與防治專(zhuān)家共識(shí)》[5]，主要依據(jù)早產(chǎn)兒頭顱影像學(xué)檢查進(jìn)行診斷。所有早產(chǎn)兒均在出生3 d 內(nèi)行首次頭顱超聲檢查，后隔周復(fù)查1次，直至出院。對(duì)頭顱超聲未見(jiàn)異常，但疑有顱內(nèi)病變者行頭顱MRI或CT檢查，確診是否存在腦損傷。若頭顱影像學(xué)檢查早期發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重腦水腫、各種類(lèi)型的顱內(nèi)出血、腦梗死、腦白質(zhì)損傷等改變，晚期發(fā)現(xiàn)多囊腦軟化、腦空洞、腦穿通畸形、嚴(yán)重腦室擴(kuò)張或腦積水及腦萎縮等改變時(shí)，視為頭顱影像學(xué)異常[5]。有上述影像學(xué)改變情況之一者，納入腦損傷組。

根據(jù)早產(chǎn)兒的頭顱影像學(xué)檢查結(jié)果，將56例早產(chǎn)兒分為腦損傷組26例和無(wú)腦損傷組30例。其中，頭顱超聲未見(jiàn)異常，但疑有顱內(nèi)病變而進(jìn)行頭顱MRI或CT檢查的早產(chǎn)兒有10例。懷疑顱內(nèi)病變的原因：(1)有4例患兒生后6 h行aEEG檢測(cè)，出現(xiàn)缺乏睡眠周期、窄帶下界電壓過(guò)低、窄帶帶寬加大、連續(xù)性低電壓、癲癎樣波形和爆發(fā)抑制等aEEG異常的表現(xiàn)；(2)有6例患兒出現(xiàn)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，如嚴(yán)重的呼吸暫停或抑制、呼吸衰竭、高碳酸血癥、中-重度貧血、多器官功能損害等。這些患兒多存在嚴(yán)重的呼吸暫?；蛞种?，驚厥，發(fā)應(yīng)低下、肌張力低下、原始反射減弱或消失等臨床表現(xiàn)。

二、方法

1.一般情況：記錄早產(chǎn)兒出生時(shí)的一般情況，包括性別、胎齡、出生體重、1 min和5 min Apar評(píng)分、分娩方式等。

2.血漿pNF-H、MMP-9水平檢測(cè)：抽取早產(chǎn)兒生后1 d、3 d、7 d的患兒動(dòng)脈血1.5 mL，使用肝素抗凝管保存，2 h內(nèi)離心(4℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min)后吸取上層血漿，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。試劑采用上海雅吉生物科技有限公司診斷試劑，并采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)進(jìn)行檢測(cè)。操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，同時(shí)記錄各組早產(chǎn)兒不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)血漿pNF-H、MMP-9指標(biāo)變化情況。

3.振幅整合腦電圖檢查(aEEG)：早產(chǎn)兒生后6 h進(jìn)行aEEG檢查。檢查采用NicoletOne視頻腦電監(jiān)測(cè)儀記錄腦電圖，監(jiān)測(cè)前常規(guī)清潔頭皮，涂抹導(dǎo)電糊，記錄電極為雙額、頂骨電極(相當(dāng)于10/20系統(tǒng)的F3，F(xiàn)4，C3，C4，P3及P4處)，參考電極位于前額中線(xiàn)距頭頂中心25 mm處，記錄時(shí)間為4～6 h。采用 Burdjalov 等創(chuàng)建的 CFM(cerebral function monitor)評(píng)分系統(tǒng)[6]對(duì)aEEG圖形結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，并由專(zhuān)業(yè)醫(yī)師通過(guò)aEEG圖形背景活動(dòng)、睡眠-覺(jué)醒周期及是否存在驚厥定性評(píng)價(jià)早產(chǎn)兒腦發(fā)育情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)于不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多元Logistic回歸分析構(gòu)建回歸方程，得到新變量(聯(lián)合預(yù)測(cè)概率)，以新變量為檢驗(yàn)變量，診斷結(jié)果為因變量，作ROC曲線(xiàn)分析，計(jì)算靈敏度、特異度及曲線(xiàn)下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

在 56例早產(chǎn)兒腦損傷中，44例早產(chǎn)兒(腦損傷組24例，無(wú)腦損傷組20例)有臨床表現(xiàn)，占78.6%，其中40例早產(chǎn)兒存在呼吸暫停或抑制狀態(tài)，5例出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)緩，9例出現(xiàn)血壓波動(dòng)，12例出現(xiàn)驚厥，7例出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高，38例出現(xiàn)反應(yīng)低下、肌張力低下、原始反射減弱或消失。

一、一般情況

兩組早產(chǎn)兒的一般情況，包括性別、胎齡、出生體重、1 min和5 min Apar評(píng)分、分娩方式，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 兩組早產(chǎn)兒一般情況比較

二、血漿pNF-H、MMP-9水平變化

腦損傷組早產(chǎn)兒生后1 d、3 d、7 d血漿 pNF-H水平較無(wú)腦損傷組均有升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦損傷組血漿 pNF-H 水平在生后3 d時(shí)檢測(cè)濃度最高，后逐漸下降，7 d明顯下降并趨于生后1 d的濃度。腦損傷組早產(chǎn)兒生后3 d與生后1 d血漿 pNF-H水平之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1 after birth，P<0.05

腦損傷組早產(chǎn)兒生后1 d、3 d、7 d血漿 MMP-9水平較無(wú)腦損傷組均有升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦損傷組血漿 MMP-9水平在生后3 d時(shí)檢測(cè)濃度最高，后逐漸下降，7 d后明顯下降并稍低于生后1 d的濃度。腦損傷組早產(chǎn)兒生后3 d與生后1 d血漿 MMP-9水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1，P<0.05

三、振幅整合腦電圖檢查(aEEG)

26例腦損傷組中aEEG結(jié)果異常為20例(76.9%)，30例無(wú)腦損傷組中aEEG結(jié)果異常為5例(16.7%)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦損傷組aEEG圖形的連續(xù)性(Cy)、睡眠-覺(jué)醒周期(Co)、寬帶(B)、總評(píng)分(T)均低于無(wú)腦損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組早產(chǎn)兒aEEG圖形的下界振幅(LB)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 腦損傷組與無(wú)腦損傷組之間aEEG監(jiān)測(cè)指標(biāo)比較

四、Logistic回歸模型

對(duì)生后第3天血漿中pNF-H、MMP-9水平及aEEG等變量行Logistic單因素分析，變量對(duì)診斷早產(chǎn)兒腦損傷均為有意義的變量(P<0.05)。故以早產(chǎn)兒腦損傷狀態(tài)(腦損傷組、無(wú)腦損傷組)為因變量，pNF-H、MMP-9及aEEG等檢測(cè)結(jié)果為自變量，采用Forward Condition方法作多元Logistic逐步回歸分析，得到回歸方程式：Logit(P)=-18.406+0.177×pNF-H+0.132×MMP-9+3.264×aEEG。診斷模型各參數(shù)詳見(jiàn)表3。

表3 多元Logistic回歸分析早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素

五、ROC曲線(xiàn)

以生后第3天血漿pNF-H、MMP-9水平、aEEG結(jié)果及三者聯(lián)合得到的總體預(yù)測(cè)概率變量為自變量，疾病診斷結(jié)果為因變量，繪制ROC曲線(xiàn)，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，生后3 d血漿pNF-H水平預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度80.8%，特異度為90.0%；生后3 d血漿MMP-9水平預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為96.7%；生后6 h行aEEG檢查預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為83.3%；三者聯(lián)合診斷的AUC顯著大于單獨(dú)檢測(cè)pNF-H、MMP-9水平及aEEG，達(dá)到97.3%，診斷的靈敏度達(dá)到96.2%，特異度達(dá)到90.0%。見(jiàn)表4。

表4 pNF-H、MMP-9、aEEG單獨(dú)檢測(cè)及運(yùn)用Logstic回歸模型診斷早產(chǎn)兒腦損傷的診斷價(jià)值(%)

圖3 pNF-H、MMP-9、aEEG單獨(dú)檢測(cè)及運(yùn)用Logistic回歸模型診斷早產(chǎn)兒腦損傷的ROC曲線(xiàn)

討 論

早產(chǎn)兒腦損傷是圍產(chǎn)期的主要并發(fā)癥，也是潛在的長(zhǎng)期神經(jīng)發(fā)育障礙。有研究表明，早產(chǎn)兒腦損傷與圍產(chǎn)期多種因素有關(guān)，包括胎齡過(guò)低、圍產(chǎn)期缺氧、感染/炎癥反應(yīng)、貧血、低血糖以及應(yīng)用機(jī)械通氣等，而存活者中多遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦癱、視力、聽(tīng)力及學(xué)習(xí)障礙等問(wèn)題，嚴(yán)重影響其生命質(zhì)量[7]。因此，應(yīng)該綜合多種方法，早期識(shí)別早產(chǎn)兒腦損傷，尋找針對(duì)性的臨床干預(yù)措施，降低早產(chǎn)兒致殘率，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)[8]。

神經(jīng)絲蛋白H(NF-H)是神經(jīng)絲蛋白的一種亞單位，在維持神經(jīng)細(xì)胞正常形態(tài)、軸漿運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮著重要作用[9]。NF-H蛋白序列是由以賴(lài)氨酸-絲氨酸-脯氨酸(KSP)序列為中心的6～8個(gè)連續(xù)重復(fù)的氨基酸序列組成的。在軸突神經(jīng)絲中，基本上所有絲氨酸殘基都磷酸化，而NF-H的樹(shù)突和核周形式在這些位點(diǎn)上通常不磷酸化，因此，KSP磷酸化形式是軸突特異性的[10]。眾所周知，這種磷酸化形式的NF-H(即pNF-H)比其他神經(jīng)絲亞單位更能抵抗鈣蛋白酶和其他蛋白酶，這表明pNF-H可能是軸突損傷和變性的一個(gè)非常好的生物標(biāo)記物。Douglas等[2]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)患兒血漿中pNF-H明顯高于對(duì)照組，且血漿pNF-H水平的升高預(yù)示著預(yù)后不良。Zurek等[11]研究發(fā)現(xiàn)，兒童創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后2 d的血漿pNF-H水平達(dá)到高峰，傷后7 d降至接近對(duì)照水平，中、重度損傷組pNF-H表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組。本研究顯示，早產(chǎn)兒腦損傷組早產(chǎn)兒在生后1 d、3 d、7 d血漿pNF-H水平較無(wú)腦損傷組顯著升高，且在生后3 d時(shí)觀察到pNF-H水平最高，且生后3 d血漿pNF-H水平預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度80.8%，特異度為90.0%。因此，pNF-H可能作為腦損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)記物。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類(lèi)鋅依賴(lài)性肽鍵內(nèi)切酶，能切割細(xì)胞外基質(zhì)，包括基膜的主要成分和內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接[12]。特別是基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)，也被稱(chēng)為明膠酶B或IV型膠原酶，在腦缺血和炎癥時(shí)可以被激活，并降解內(nèi)皮基底膜的IV型膠原，導(dǎo)致血腦屏障的破壞，增加腦水腫、細(xì)胞凋亡等病理反應(yīng)[3]。有研究表明，當(dāng)早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生時(shí)，在多種炎癥因子、細(xì)胞免疫反應(yīng)的刺激下，MMP-9 表達(dá)可在短期內(nèi)形成瀑布效應(yīng)，但隨患兒病情緩解及在各類(lèi)臨床干預(yù)措施對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用下，MMP-9 表達(dá)也隨之降低[13]。Okamoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，腦室周?chē)?腦室內(nèi)出血(periventricular-intraventricular hemorrhage，PVH-IVH)后腦室擴(kuò)張患兒腦脊液中的MMP-9水平明顯高于對(duì)照組，并認(rèn)為MMP-9可以降解廣泛沉積在蛛網(wǎng)膜下腔的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在阻止和解決腦室擴(kuò)張中起重要作用。本研究顯示腦損傷組早產(chǎn)兒在生后1 d、3 d、7 d血漿MMP-9水平較無(wú)腦損傷組顯著升高，且在生后3 d時(shí)檢測(cè)濃度最高，且生后3 d血漿MMP-9水平預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為96.7%。因此生后不久檢測(cè)早產(chǎn)兒血漿中MMP-9水平有利于早產(chǎn)兒腦損傷的早期預(yù)測(cè)。

近年來(lái)，aEEG在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)中越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于新生兒腦功能的連續(xù)監(jiān)測(cè)。目前，aEEG臨床應(yīng)用的主要領(lǐng)域是足月嬰兒出生窒息后腦結(jié)局的預(yù)測(cè)，腦癲癇活動(dòng)的檢測(cè)和抗癲癇藥物治療的監(jiān)測(cè)，而在早產(chǎn)兒方面，可以利用Burdjalov評(píng)分描述皮層電活動(dòng)的生理成熟，間接地提供了對(duì)病理模式的測(cè)量[15]。有研究顯示，aEEG低電壓、背景活動(dòng)不連續(xù)和缺失成熟的睡眠覺(jué)醒周期與早產(chǎn)兒不良預(yù)后甚至與死亡有關(guān)[16]。此外，早產(chǎn)兒振幅整合腦電圖的異常背景活動(dòng)較影像學(xué)表現(xiàn)更早出現(xiàn)，更利于早期診斷早產(chǎn)兒腦損傷。本研究顯示，腦損傷組與無(wú)腦損傷組中aEEG異常的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦損傷組aEEG圖形的連續(xù)性(Cy)、睡眠-覺(jué)醒周期(Co)、寬帶(B)、總評(píng)分(T)均低于無(wú)腦損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生后6 h行aEEG檢查預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為83.3%，說(shuō)明 aEEG 可在一定程度上對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。

本研究還采用了Logistic回歸及ROC來(lái)評(píng)價(jià)pNF-H、MMP-9聯(lián)合aEEG對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究3項(xiàng)指標(biāo)的回歸分析中比值比(odds ratio，OR)均大于1，提示這些指標(biāo)升高或異常會(huì)增加早產(chǎn)兒腦損傷風(fēng)險(xiǎn)；ROC曲線(xiàn)顯示，三者聯(lián)合診斷的AUC顯著大于單獨(dú)檢測(cè)pNF-H、MMP-9水平及aEEG，達(dá)到97.3%，說(shuō)明三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷診斷價(jià)值最高；生后3 d血漿pNF-H、MMP-9及aEEG的靈敏度較低，特異度較高，表明其診斷早產(chǎn)兒腦損傷容易漏診，也就是說(shuō)假陰性比較高；而三者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯提高，達(dá)到96.2%，特異度也達(dá)到90.0%，說(shuō)明三者聯(lián)合檢測(cè)可以顯著提高診斷早產(chǎn)兒腦損傷的靈敏度，減少漏診，從而盡早對(duì)腦損傷的早產(chǎn)兒進(jìn)行干預(yù)和治療。

綜上所述，pNF-H、MMP-9聯(lián)合aEEG對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷具有早期預(yù)測(cè)價(jià)值。早產(chǎn)兒腦損傷病因復(fù)雜，臨床上無(wú)明顯特異性表現(xiàn)，一旦發(fā)生無(wú)特效治療，重在預(yù)防。因此，需要根據(jù)時(shí)機(jī)合理聯(lián)合兩個(gè)或兩個(gè)以上的診斷方法進(jìn)行精準(zhǔn)和全面的診斷，并盡早對(duì)腦損傷的早產(chǎn)兒進(jìn)行干預(yù)及治療。急性期可以對(duì)癥處理，包括避免和減少對(duì)患兒的不良刺激，優(yōu)化呼吸管理，維持體溫、血壓、電解質(zhì)穩(wěn)定，積極控制感染及驚厥等；恢復(fù)期則以康復(fù)治療為主，以期真正改善早產(chǎn)兒遠(yuǎn)期神經(jīng)發(fā)育不良的預(yù)后。由于本研究樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，將來(lái)有必要進(jìn)一步研究 pNF-H、MMP-9、aEEG和神經(jīng)發(fā)育預(yù)后的關(guān)系。