俯臥位通氣對海水淹溺型急性呼吸窘迫綜合征大鼠的治療作用

孔敏　徐淼　和秋莉　　袁孝忠　周煦燕　徐龍生　　楊茂憲

[摘要] 目的 探討俯臥位通氣對海水淹溺所致急性呼吸窘迫綜合征大鼠的治療作用及其機制。 方法 32只雄性SD大鼠隨機分為對照組、ARDS組、仰臥位通氣組（S組）及俯臥位通氣組（P組），每組各8 只。通過氣管內(nèi)滴注海水4 mL/kg建立ARDS動物模型。對照組、ARDS 組2 h后檢測各指標(biāo);S組及P組在ARDS建模后分別進行仰臥位或俯臥位機械通氣2 h后檢測指標(biāo)。檢測動脈血氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）、肺濕/干質(zhì)量（W/D）比值;收集支氣管肺泡灌洗液并測定上清液中蛋白水平;肺組織勻漿后檢測髓過氧化物酶（MPO）及腫瘤壞死因子水平-α（TNF-α）。 結(jié)果 與對照組比較，ARDS組、S組、P組PaO2均明顯降低（P<0.05）;與S相比較，P組PaO2增高（P<0.05）;與P組比較，ARDS組、S組PaCO2 均明顯升高（P<0.05）;與ARDS 組比較，S組、P組肺 W/D 比值及BALF中總蛋白含量均明顯降低（P均<0.05）;與P 組比較，S組肺 W/D 比值及BALF中蛋白含量均明顯增高（P<0.05），ARDS組及S組肺組織MPO及TNF-α顯著升高（P均<0.05）;顯微鏡下，與S組比較，P組塌陷肺泡占比減少，膨脹肺泡占比減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。 結(jié)論 俯臥位通氣可改善海水淹溺急性呼吸窘迫綜合征大鼠的通氣功能，減輕肺部炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 俯臥位通氣;急性呼吸窘迫綜合征;大鼠;海水淹溺型

[中圖分類號] R714.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）11-0026-04

Therapeutic efficacy of prone position ventilation on rats with acute respiratory distress syndrome of seawater drowning type

KONG Min1? ?XU Miao1? ?HE Qiuli1? ?YUAN Xiaozhong1? ?ZHOU Xuyan1? ?XU Longsheng2? ?YANG Maoxian3

1.Department of Anesthesiology， Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314001， China; 2.Central Laboratory， Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314001， China; 3.Intensive Care Unit， Affiliated Hospital of Jiaxing University， Jiaxing? ?314001， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic efficacy and mechanism of prone position ventilation on rats with acute respiratory distress syndrome（ARDS） of seawater drowning type. Methods A total of 32 male SD rats were randomLy divided into the control group（n=8）， the ARDS group（n=8），the supine ventilation group （the S group， n=8） and the prone ventilation group（the P group， n=8）. ARDS animal model was established by intratracheal instillation of seawater with 4 mL/kg. The indexes of the control group and the ARDS group were detected after 2 hours. The indexes of the S group and the P group were detected after 2 hours of mechanical ventilation in supine or prone position after ARDS modeling， respectively. The arterial oxygen partial pressure（PaO2）， carbon dioxide partial pressure （PaCO2）， and lung wet/dry mass （W/D） ratio were measured. Bronchoalveolar total lavage fluid （BALF） was collected and the protein level in the supernatant was determined.The levels of myeloperoxidase （MPO） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in lung homogenate were detected. Results Compared with the control group， PaO2 in the ARDS group， the S group and the P group decreased significantly（P<0.05）. Compared with the S group， PaO2 in the P group increased significantly（P<0.05）， and compared with the P group， PaCO2 in the ARDS group and the S group both increased significantly（P<0.05）. Compared with the ARDS group， the lung W/D ratio and protein content in BALF of the S group and the P group both decreased significantly（P<0.05）. Compared with the P group， the lung W/D ratio and protein content in BALF of the S group both increased significantly（P<0.05）， while MPO in lung tissue and TNF-α in the ARDS group and the S group increased significantly（all P<0.05）. Under microscope， compared with the S group， the proportion of collapsed alveoli and expanded alveoli in the P group decreased，all with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion Prone position ventilation can improve the ventilation function of rats with ARDS after seawater drowning and reduce the inflammatory reaction in lungs.

[Key words] Prone position ventilation; Acute respiratory distress syndrome; Rats; Seawater drowning type

急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由肺外源性和（或）肺內(nèi)源性引起的以嚴(yán)重的低氧血癥和（或）高碳酸血癥為臨床特征的呼吸衰竭[1-2]。目前尚無能夠針對引起該病的病理生理機制，即肺泡毛細(xì)血管通透性增加進行治療的方法，主要的治療策略是機械通氣治療，它也可能引起呼吸機相關(guān)性肺損傷[3-4]。目前的觀點認(rèn)為俯臥位通氣聯(lián)合肺保護性通氣策略可以作為輕度、中度ARDS的一線救治方法[5-6]。既往研究發(fā)現(xiàn)俯臥位通氣可以降低ARDS患者病死率[7-8]，但俯臥位通氣治療因海水淹溺引起的ARDS未見報道。海水淹溺后大多數(shù)患者容易引起肺泡毛細(xì)血管膜損傷，通透性增加，繼發(fā)肺水腫，并繼發(fā)海水急性呼吸窘迫綜合征（Seawater inhalation induced acute respiratory distress syndrome，SW-ARDS），病死率極高[9-10]。本研究通過復(fù)制海水淹溺型ARDS大鼠模型，采用俯臥位通氣對其治療，為防治海水淹溺ARDS提供了新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague Dawley大鼠，32只，體重200～230 g，購買于南京市青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK（蘇）2017-0001。按照隨機數(shù)字表方法分為四組：對照組、海水淹溺組（ARDS組）、仰臥位通氣組（S組）、俯臥位通氣組（P組），每組各8只。本研究中實驗動物處置方法符合動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實驗材料和試劑

配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海配方海水，滲透壓1250～1350 mmol/L，pH值 8.20，密度1.05～1.06 kg/L，NaCl 6.518 g/L，MgCl2 2.447 g/L，MgSO4 3.305 g/L，CaCl2 1.41 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHC03 0.202 g/L，NaBr 0.083 g/L。i-STAT血氣分析儀（美國），小動物呼吸機（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠，DH-150型），二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒（海門碧云天公司），腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α），ELISA試劑盒（武漢博士德生物有限公司），髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）測試盒（南京建成科技公司）、MULTSKAN-MK3酶標(biāo)儀（德國 Thermo公司），電子內(nèi)窺鏡（深圳浩特爾電子技術(shù)有限公司），Allegnex-22高速離心機（美國Becman公司），氣管插管（中國新航科技有限公司）。

1.3 動物模型

大鼠自由活動，模型制備前12 h禁食，不禁飲。腹腔注射給予戊巴比妥鈉50 mg/kg全身麻醉，將大鼠頭高腳低仰臥固定于操作臺。借助電子內(nèi)窺鏡暴露聲門，將氣管插管插入大鼠氣管內(nèi)。抬高操作臺頭側(cè)，與水平面呈45°夾角。海水淹溺組、S組、P組3 min內(nèi)氣管內(nèi)滴注海水4 mL/kg，并做錐形旋轉(zhuǎn)，使海水在肺內(nèi)各葉均勻分布。模型制備參照文獻[11]。

1.4 機械通氣呼吸機設(shè)置

1.4.1 各組通氣方式? 對照組為正常大鼠，不進行機械通氣;ARDS組：在ARDS模型建立后不行機械通氣;S組：在ARDS模型建立后，腹腔注射維庫溴銨2 mg/kg使自主呼吸消失，連接小動物呼吸機行仰臥位機械通氣;P組：在ARDS模型建立后，腹腔注射維庫溴銨2 mg/kg使自主呼吸消失，連接小動物呼吸機行俯臥位機械通氣。

1.4.2 呼吸機參數(shù)設(shè)置? 呼吸機通氣模式為容量控制，潮氣量6 mL/kg，呼吸頻率為60次/min，F(xiàn)iO2 21%，吸氣與呼吸時間比值為1∶2，連續(xù)通氣2 h。對照組和ARDS組在模型建立2 h后進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。S組和P組在機械通氣2 h后再進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中蛋白測定? 用4℃生理鹽水灌洗右肺下葉支氣管肺泡3次，依次為2、2、1 mL?；厥展嘞匆?℃條件下，轉(zhuǎn)速1500 r/min，離心半徑80 mm，離心10 min，取上清液采用分光光度計測定BALF中總蛋白。

1.5.2 肺組織濕/干質(zhì)量比? 各組大鼠放血處死后，迅速取出左肺上葉，吸干肺表面水分和血液，電子天平稱其濕重，放置于75℃烤箱中72 h至恒重，再稱干重，用肺濕重除以干重計算肺濕/干重比。

1.5.3 動脈血氣分析? 用1 mL注射器從分離的大鼠股動脈穿刺取1 mL動脈血，檢測動脈血氧分壓和二氧化碳分壓。

1.5.4 肺組織中的MPO活性及TNF-α含量測定? 取出左肺上葉，用4℃生理鹽水溶液清洗肺組織標(biāo)本表面的血污，稱重，按照質(zhì)量1∶5的比例將組織在相應(yīng)質(zhì)量的生理鹽水溶液中勻漿。組織勻漿在4℃條件下，3000 r/min，離心半徑80 mm，離心15 min后提取上清。分別按照試劑盒提供的步驟，采用ELISA的方法檢測上清液中TNF-α含量、采用化學(xué)比色法檢測上清液中MPO的活性。

1.5.5 肺組織病理學(xué)評分? 取大鼠右肺中葉，約2 mm厚，10%甲醛溶液固定24 h、脫水、浸蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosinstaining，HE）染色。2名觀察者在顯微鏡下同時選取10個互不重疊的視野并分別評分后取平均值，當(dāng)不一致評分時進行復(fù)檢，達成最終意見一致。評分標(biāo)準(zhǔn)：肺泡過度膨脹（肺泡管、肺泡囊和肺泡的最大中空弦長>120 μm）;肺泡塌陷（肺泡壁折疊、肺泡形狀扭曲）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用One-way ANOVA分析，多個均數(shù)的兩兩比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動脈血氧分壓和二氧化碳分壓的變化比較

與對照組比較，ARDS組的PaO2降低，PaCO2升高;S組的PaO2高于ARDS組;P組大鼠PaO2高于ARDS組和S組，P組PaCO2低于ARDS組及S組（P均<0.05）。

2.2 各組大鼠肺W/D，BALF中蛋白含量、肺組織MPO、TNF-α含量的變化比較

ARDS組肺W/D，BALF中總蛋白含量、肺組織MPO、TNF-α含量均較對照組升高;S組肺W/D、BALF中蛋白含量較ARDS組降低;P組肺W/D、BALF中蛋白含量、肺組織MPO、TNF-α含量較S組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化

ARDS組較對照組塌陷肺泡比例增加，S組較ARDS組塌陷肺泡占比降低，膨脹肺泡占比較ARDS組增加;P組較ARDS組及S組膨脹肺泡及塌陷肺泡占比降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。

3 討論

本研究中，通過氣管內(nèi)滴注海水構(gòu)建海水淹溺型大鼠的ARDS模型，觀察海水淹溺導(dǎo)致的ARDS中肺損傷的變化，結(jié)果海水淹溺后，肺組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞增多，肺泡萎陷，肺水腫。通過肺病理組織學(xué)改變和動脈血氣分析提示肺損傷存在。采用俯臥位通氣，改善了急性呼吸窘迫綜合征氣體交換，降低肺部炎癥水平，減輕肺水腫。

溺水已逐漸成為世界范圍內(nèi)最常見的意外死亡原因之一[12]。高滲性海水吸入會引起嚴(yán)重的肺水腫，因為局部高通透性會驅(qū)使液體從血管進入肺泡和肺組織間隙。這些因素誘發(fā)ALI或ARDS。并且，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺組織中富集，并分泌促炎因子，如NO、COX-2、TNF-α、IL-1抗氧化蛋白（IL-1）和IL-6[13]。此外，肺組織中炎癥細(xì)胞的積累導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激失衡[14]。過度的炎癥細(xì)胞因子和MPO被認(rèn)為與ARDS的發(fā)生密切相關(guān)[15]。雖然臨床對ARDS患者采用了多種藥物和治療方法，但均未顯著降低ARDS患者頑固性低氧血癥，行呼吸機通氣治療改善肺氧合仍是目前治療ARDS的重要手段[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海水淹溺模型中，海水吸入增加了肺內(nèi)含水量，促進了TNF-α的分泌，抑制了肺組織攜氧及氣體交換能力。在給予俯臥位通氣后，較仰臥位通氣肺氧合能力提高，炎性細(xì)胞因子降低，肺水腫情況改善。氣體交換和肺水腫的改善可能與俯臥位通氣減輕肺水腫疊加在重力依賴區(qū)肺組織壓縮性肺不張以及毛細(xì)血管壓迫引起通氣血流比例失調(diào)有關(guān)[17]。然而，仰臥位通氣也導(dǎo)致肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子的表達增加。這些結(jié)果表明，仰臥位通氣較俯臥位通氣可能導(dǎo)致較大的生物傷，并釋放促炎細(xì)胞因子。在本研究中，仰臥位通氣中氣體分布不均勻引起局部區(qū)域過度膨脹，會拉伸肺泡細(xì)胞，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的釋放[18-19]。這種炎癥反應(yīng)可能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤肺組織和肺泡腔導(dǎo)致髓過氧化物酶增加[20]。本研究俯臥位通氣組與仰臥位通氣組相比，MPO的激活和炎癥細(xì)胞因子如TNF-α的分泌均受到明顯抑制。這可能與俯臥位通氣減輕肺泡，改善氣體交換的通氣，改善分泌物引流，降低海水淹溺至肺出血，誘發(fā)的氧化應(yīng)激等有關(guān)[21-22]。

本研究采用海水淹溺急性呼吸窘迫綜合征大鼠模型，與臨床上人海水淹溺急性呼吸窘迫綜合征密切相關(guān)[23]。目前未提供俯臥位通氣期間實際使用的平臺壓、呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性等呼吸力學(xué)指標(biāo)。因此，在未來的研究中，還應(yīng)使用適當(dāng)?shù)?、特定的設(shè)備和技術(shù)來確定俯臥位對這些參數(shù)的影響。目前的實驗設(shè)計也可用于其他已建立的急性呼吸窘迫綜合征模型，進一步驗證當(dāng)前的實驗結(jié)果。

綜上所述，俯臥位通氣改善海水淹溺急性呼吸窘迫綜合征大鼠的通氣功能，減少肺泡塌陷區(qū)域，降低肺水腫和肺部炎癥反應(yīng)。

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（收稿日期：2020-10-24）