AngⅡ及AT1R在膀胱腫瘤發(fā)生發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的意義*

涂小峰, 李中軍, 韓新軍, 胡義

1鄭州市第七人民醫(yī)院急診科(河南鄭州 450016)； 2河南省人民醫(yī)院泌尿外科(河南鄭州 450003)

膀胱癌是泌尿外科常見的一類生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性中發(fā)病率較高，是女性的3～4倍，其患病率呈逐年增加趨勢(shì)[1-2]。膀胱癌好發(fā)于為50～60歲人群，其發(fā)病率和進(jìn)展復(fù)發(fā)率均較高，若未得到及時(shí)診治，從出現(xiàn)癥狀到病死時(shí)間平均16個(gè)月[3-4]。預(yù)后控制不佳主要?dú)w因于尚未完全闡明膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，膀胱癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移程度及分化程度對(duì)患者預(yù)后影響最大。因此，闡明膀胱癌發(fā)生、進(jìn)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的生物分子標(biāo)志物用于早期診治及預(yù)后評(píng)估將具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中活性小分子多肽，主要作用是調(diào)節(jié)心血管和腎臟穩(wěn)態(tài)及水、電解質(zhì)代謝平衡，AngⅡ主要是通過血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ 1 receptor,AT1R)來發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用這些細(xì)胞效應(yīng)的[5]。近年研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ及AT1R參與肝癌、胃癌等多種癌癥組織表達(dá)上調(diào)[6]，腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ及AT1R與腫瘤的血管生成、增殖和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，AngⅡ及AT1R的表達(dá)增加，意味著臨床分期晚和浸潤(rùn)更深，預(yù)后不佳[7-9]。但它們表達(dá)及失衡情況與膀胱癌發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究免疫組化SP法和熒光定量RT-PCR檢測(cè)60例膀胱癌患者AngⅡ及AT1R表達(dá)情況，探討其與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6 月至2019年12月鄭州市第七人民醫(yī)院收治的術(shù)后膀胱癌組織及其癌旁正常膀胱癌組織60例，其中男35例，女25 例，年齡30～70歲，平均(53.46±5.65) 歲，根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期: 其中Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期10例，腫瘤最大徑1～5 cm，平均(3.63±0.56)cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理組織確診為膀胱癌[10]；(2)術(shù)前未接受任何放化療治療；(3)無精神認(rèn)知功能障礙，可進(jìn)行良好溝通；(4)患者或其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): (1)合并有心、肝、腎嚴(yán)重功能不全患者；(2)妊娠及哺乳期婦女；(3)不同意參加研究者。研究已經(jīng)鄭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：L2017011)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化檢測(cè)AngⅡ及AT1R蛋白表達(dá) 多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，約4 μm厚，經(jīng)常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，使用3%的過氧化氫避光孵育30 min抑制內(nèi)源性氧化酶，用山羊血清封閉，加入一抗工作液(AngⅡ和AT1R兔抗人多克隆抗體，稀釋比均為1∶150)，4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育60 min，采用DAB顯色蘇木素復(fù)染3 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片，采用已知表達(dá)性的切片作為陽(yáng)性對(duì)照，使用PBS 緩沖液代替一抗性作為陰性對(duì)照。

1.2.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)AngⅡ及AT1R mRNA表達(dá) 二甲苯脫蠟，無水乙醇洗去殘留二甲苯，室溫干燥，加入組織裂解液和蛋白酶K于55℃金屬浴孵育器2 h；根據(jù)Trizol法提取組織總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并計(jì)算總RNA的A260/A280，比值在1.6～2.0范圍即為純度合格，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格根據(jù)TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照，去離子水作為陰性對(duì)照。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見下表，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；最后于72℃ 5 min，采用2-ΔΔCt表示表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 指標(biāo)觀察和標(biāo)準(zhǔn) AngⅡ及AT1R 均著色在細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上，AngⅡ染色為淺黃色、棕黃色或深棕色。AT1R染色為淺黃色、棕黃色或棕褐色，所有切片均隨機(jī)取5個(gè)視野在400倍高倍鏡下觀察，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色程度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。著色程度評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，深棕色或棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。著色程度+陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分為總分，10分以下分為陰性，10分及以上為陽(yáng)性[11]。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ及AT1R蛋白在癌組織及旁癌組織中的表達(dá)情況 膀胱癌組織AngⅡ及AT1R蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常膀胱癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，見表2、圖1。

表2 AngⅡ及AT1R蛋白在癌組織及旁癌組織中表達(dá)情況 例(%)

注：A：AngⅡ在膀胱癌組織中表達(dá)，B：AngⅡ在膀胱癌旁組織中表達(dá)，C：AT1R在膀胱癌組織中表達(dá)，D：AT1R在膀胱癌旁組織中表達(dá)

2.2 AngⅡ和AT1R mRNA在癌組織及旁癌組織中的表達(dá) 膀胱癌組織AngⅡ的 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.89±0.51，癌旁組織的為1.06±0.25，膀胱癌組織AT1R mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.95±0.53，癌旁組織的1.04±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 AngⅡ蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系 AngⅡ蛋白及mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)均與腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，見表3。

2.4 AT1R蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系 AT1R蛋白及mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)均與腫瘤的分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)，見表4。

2.5 AngⅡ和AT1的影響因素logistic回歸分析 以性別(男=0，女=1)、年齡(≥50歲=1，<50歲=2)、腫瘤直徑大小(≤3 cm=0，>3 cm=1)、分化程度(低分化=1，中分化=2，高分化=3)、浸潤(rùn)深度(淺表浸潤(rùn)=1，肌層浸潤(rùn)=2)、TNM分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)為自變量，以AngⅡ及AT1R為因變量，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，膀胱癌患者的分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會(huì)明顯影響AngⅡ及AT1R的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5～6。

表3 AngⅡ蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表4 AT1R蛋白及mRNA與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表5 AngⅡ的影響因素logistic回歸分析

表6 AT1R的影響因素logistic回歸分析

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，主要來源于膀胱上皮組織和間質(zhì)組織。膀胱癌根據(jù)組織學(xué)類型可分為移行細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及混合型[12]。其中移行細(xì)胞癌占絕大部分，根據(jù)浸潤(rùn)程度，淺表性約占70%，20%為浸潤(rùn)性[13-14]，目前臨床上治療膀胱癌采用手術(shù)治療為主的綜合治療，但預(yù)后較差，主要原因是確診時(shí)大多已發(fā)生轉(zhuǎn)移并且膀胱癌復(fù)發(fā)率高[15],因此實(shí)現(xiàn)早期診斷膀胱癌對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義，然而目前的技術(shù)手段仍有一定難度。從目前研究來看，細(xì)胞浸潤(rùn)深度和轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后影響頗大，從分子和基因?qū)用鎭砜?，膀胱癌的浸?rùn)和轉(zhuǎn)移具有明顯的遺傳特征，但膀胱癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明。故探討膀胱癌進(jìn)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有效評(píng)估膀胱癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期和改善預(yù)后具有重要的意義。

以往研究AngⅡ和AT1R的功能主要集中于調(diào)節(jié)心血管功能，如參與調(diào)節(jié)血管的收縮、細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和分化，以及形成細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥。近年來AngⅡ和AT1R在腫瘤中的作用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[16]。但其在膀胱癌進(jìn)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用卻鮮見報(bào)道，對(duì)此，本研究采用免疫組化SP法和熒光定量PCR檢測(cè)PTC 組織及癌旁正常膀胱癌組織的AngⅡ和AT1R蛋白和mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織的AngⅡ和AT1R 蛋白和mRNA明顯高于癌旁正常組織，提示AngⅡ和AT1R與膀胱癌的進(jìn)展密切相關(guān)。通過分析AngⅡ和AT1R與臨床病理特征相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，AngⅡ及其AT1R與分化程度、臨床分期、浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，意味著臨床分期越晚，組織分化越差，浸潤(rùn)程度更深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重，則表達(dá)水平越高,表明AngⅡ及其AT1R是浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志。膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移屬于多因素參與的病理生物學(xué)過程。侵襲轉(zhuǎn)移包括腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的一些列過程，包括腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、黏附、遷移、生長(zhǎng)、新血管生成、逃避免疫等多種行為。據(jù)以往研究顯示在腫瘤組織中，AngⅡ主要通過AT1R結(jié)合通過激活促使了腫瘤的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移，而可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)以及腫瘤血管的生成，AT1R可促進(jìn)細(xì)胞增殖激活表皮生長(zhǎng)因子受體，激活ERK1/2級(jí)聯(lián)效應(yīng)，并持續(xù)激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，包括編碼抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和myc，以及促血管發(fā)生因子VEGF，促使細(xì)胞的異常增殖并阻斷其凋亡[17-20]。Dolley-Hitze等[21]通過免疫組織化學(xué)法、蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AT1R在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于在正常組織中的表達(dá)。Shirotake等[22]對(duì)檢測(cè)膀胱腫瘤組織AT1受體，發(fā)現(xiàn)在肌層浸潤(rùn)膀胱癌組織AT1受體陽(yáng)性表達(dá)率為76%，明顯高于非肌層浸潤(rùn)組織的43%。Arrieta等[23]發(fā)現(xiàn)AT1受體陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與星形膠質(zhì)瘤腫瘤惡性分級(jí)、細(xì)胞增殖、血管增生明顯相關(guān)。進(jìn)一步的，多因素分析顯示膀胱癌患者的分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會(huì)明顯影響AngⅡ及AT1R的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了AngⅡ及AT1R的表達(dá)與膀胱癌患者浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本研究結(jié)果提示AngⅡ及AT1R的表達(dá)上調(diào)與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)的AngⅡ及AT1R提示膀胱腫瘤細(xì)胞更具有明顯的侵襲性。因此，可通過檢測(cè)膀胱腫瘤組織AngⅡ及AT1R表達(dá)評(píng)估膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移程度，以及膀胱癌的預(yù)后，可通過給予針對(duì)性的治療延緩膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，AngⅡ及AT1R mRNA在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量與膀胱癌的分化程度密切相關(guān)。提示AngⅡ及AT1R有望成為膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)，且可望成膀胱癌靶向治療的有效靶點(diǎn)。