Peiminine通過調(diào)控COX-2/PGE2/EGFR信號通路促進(jìn)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

饒 軍 熊愛華 張康梅 何勤思 鄭 智

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢，平均發(fā)病年齡在41～65歲[1]。近二十年來，結(jié)腸癌尤其是晚期結(jié)腸癌的臨床療效仍未獲得明顯改善，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。隨著對中醫(yī)藥研究的不斷深入，中醫(yī)藥在癌癥綜合治療中的作用和地位得到了重視和提高，中西醫(yī)結(jié)合腫瘤治療已成為我國惡性腫瘤治療中不可或缺的重要組成部分[2-3]。在前期的研究工作中，我們對貝母素乙(Peiminine)抗癌機(jī)制進(jìn)行了一些探索和總結(jié)，其具有鎮(zhèn)靜、抗炎，抗肺纖維化，抗過敏、增強(qiáng)耐藥腫瘤細(xì)胞對藥物敏感性等作用。本文擬進(jìn)一步研究Peiminine對COX-2/PGE2/EGFR信號通路的調(diào)控作用，或?yàn)檫M(jìn)一步治療結(jié)腸癌患者指出新的方向。

1 材料與方法

1.1 藥物及細(xì)胞株

貝母素乙(Peiminine)購自于中國食品藥品檢定所，人結(jié)腸癌 HCT-116 細(xì)胞由清華大學(xué)生命科學(xué)院友好提供。

1.2 主要試劑與儀器

PGE2 ELISA試劑盒由晶美生物有限公司上海分公司提供；封閉緩沖液：含5% (w/v) 脫脂奶粉的PBS緩沖液；1 × PBS緩沖液(上海生工)；二抗緩沖液：150 mM NaCl，50 mM Tris-Cl pH7.5；ECL底物顯色液(Thermo)；一抗：COX-1(proteintech，13393-1-AP)、COX-2(proteintech，12375-1-AP)、P-ERK(Santa Cruz，sc-7383)、ERK(proteintech，11049-1-AP)、P-P38(Santa Cruz，sc-166182)、P38(proteintech，14064-1-AP)、P-P53(Santa Cruz，sc-377567)、P53(proteintech，60283-2-Ig)、NF-κB(proteintech，10745-1-AP)、IL-6(proteintech，66146-1-Ig)、IL-10(proteintech，20850-1-AP)；二抗：HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠；TRIZOL(sigma)；DEPC-H2O(上海生工)；氯仿(國藥集團(tuán))；異丙醇(國藥集團(tuán))；無水乙醇(國藥集團(tuán))；70%乙醇(國藥集團(tuán))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；一般PCR試劑(TaKaRa)。

Western blot轉(zhuǎn)移電泳槽：Tanon VE186；垂直電泳槽：Tanon VE180；凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD Gel Doc XR+；低溫高速離心機(jī)：Thermo ST40R；Roche 480 熒光定量PCR儀；分析軟件：BIO-RAD Image Lab Software，Version 5.1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HCT116細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞，放至37 ℃，5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況以及培養(yǎng)液的變化情況，每2～3天換液1次；細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶面積90%左右時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代或凍存。選擇第2～5代生長良好的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。以每孔 250 μg 的貝母素乙加入，處理48 h后收集細(xì)胞。

1.4 Real-time qPCR法

Trizol法提取RNA，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用1×PBS加入培養(yǎng)瓶中，輕微洗干凈，再將培養(yǎng)瓶放置于冰上，加入800 μl Trizol，反復(fù)吹打，將貼壁細(xì)胞全部吹打下來，轉(zhuǎn)到1.5 ml EP管中；加入200 μl氯仿，劇烈震蕩混勻；于4 ℃離心12 000 rpm，5 min；將上清轉(zhuǎn)入1.5 ml小管中，加入與上清等體積的異丙醇，-20 ℃放置1 h或更長(充分沉淀)不要吸取中層物質(zhì)，否則會有DNA污染；于4 ℃離心12 000 rpm，5 min；小心移去上清，防止沉淀丟失；用70%乙醇洗2遍，每次700 μl，12 000 rpm，4 ℃，5 min；小心的盡可能吸走上清，超凈臺上倒置將酒精空干；加入30 μl DEPC-H2O溶解，-70 ℃保存。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)說明書，并按照一般定量PCR試劑體系(TaKaRa)進(jìn)行熒光定量PCR。

1.5 Western Blot法

細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，每孔中分別加入200 μl細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白。提取好總蛋白后采用BCA法進(jìn)行定量，將每個(gè)樣本的濃度調(diào)制基本一致。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?0 μl收集的蛋白中，加入150 μl 4×loading buffer，混勻后，100 ℃水浴5 min，冰上冷卻。配置好分離膠和濃縮膠，每孔上樣40 μl，電泳90 min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后關(guān)掉電源，取出PVDF膜放入容器(培養(yǎng)皿)中，加適量的封閉緩沖液[含5%(w/v)脫脂奶粉的PBS緩沖液]，室溫輕輕搖動(dòng)溫育1～2 h。換新的培養(yǎng)皿，加入10 ml上述封閉緩沖液，并按1∶1 000的量加入一抗，4 ℃ 孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3次，每次10 min。將PVDF膜轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，加入含有5%脫脂奶粉的二抗緩沖液，并以1∶5 000量加入二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG)，室溫?fù)u動(dòng)溫育1 h。再將PVDF膜轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，加適量二抗緩沖液(150 mM NaCl，50 mM Tris-Cl pH7.5)，室溫洗滌3次，每次10 min。ECL加底物顯色液，拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ELISA法測定PGE2的變化

本研究利用ELISA試劑盒方法測定Peiminine處理人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后PGE2含量的變化，結(jié)果顯示，與對照組(Ctrl)相比，Peiminine處理后細(xì)胞內(nèi)PGE2含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。這表明，Peiminine藥物能顯著抑制PGE2的生成。

圖1 ELISA法測定PGE2的表達(dá)變化

2.2 Real-time qPCR和Western Blot法測定COX-1和COX-2的變化

Real-time qPCR分別測定了Peiminine處理人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后COX-1和COX-2基因表達(dá)量的變化。如圖2所示，Peiminine處理后細(xì)胞內(nèi)COX-1和COX-2的含量都比對照組(Ctrl)的低，但只有COX-2的變化具有顯著性(P<0.01)。為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果，我們接著采用Western Blot法測定COX-1和COX-2的變化(圖3)，結(jié)果顯示Peiminine處理后細(xì)胞內(nèi)COX-2含量降低比較明顯，相比而言，COX-1的變化不大顯著。這表明Peiminine藥物能顯著抑制COX-2基因及其蛋白的表達(dá)。

圖2 熒光定量PCR分析COX-1和COX-2表達(dá)變化

圖3 WB分析對照組和250 μg的貝母素乙處理細(xì)胞組中的相關(guān)蛋白表達(dá)變化

2.3 Real-time qPCR和Western Blot法測定IL-6、IL-10和NF-κB的變化

針對IL-6、IL-10和NF-κB的變化進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組(Ctrl)相比，Peiminine處理后細(xì)胞內(nèi)IL-6和NF-κB含量均顯著性降低(P<0.01)，而IL-10含量明顯升高(P<0.01)，見圖4。Western Blot法測定結(jié)果也證實(shí)了Peiminine藥物能影響相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，顯著降低IL-6和NF-κB的表達(dá)量而促進(jìn)IL-10含量的升高，見圖3。

圖4 熒光定量PCR分析IL-6、IL-10和NF-κB表達(dá)變化

2.4 Western Blot法測定EGFR信號通路中的關(guān)鍵蛋白

基于Western Blot法研究了EGFR信號通路中關(guān)鍵蛋白(ERK、P-ERK、P53、P-P53、P38和P-P38)表達(dá)量的變化。根據(jù)灰度值可以發(fā)現(xiàn)Peiminine處理后細(xì)胞這6種蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.01)，見圖3。這說明Peiminine藥物能抑制EGFR信號通路，調(diào)控其關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。

3 討論

研究表明Peiminine可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，激活A(yù)MPK 信號通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[4-6]。高通量非靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果表明經(jīng)過Peiminine處理后57 種代謝物發(fā)生顯著性變化 (P≤0.05)，其中部分差異的代謝物參與 PI3K/Akt/mTOR 的調(diào)控或者與氧化應(yīng)激有關(guān)。更重要的是一半以上(32/57)的差異代謝物都是脂類化合物，這其中涉及到不飽和脂肪酸代謝的COX-2/PGE2通路。為了進(jìn)一步證實(shí)Peiminine對COX-2/PGE2/EGFR信號通路的調(diào)控作用，本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來研究Peiminine對該通路中的相關(guān)基因、炎癥因子及其相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。

已有研究證實(shí)多不飽和脂肪酸與癌癥(包括結(jié)腸癌)的發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。一方面 ω-6 PUFA(花生四烯酸)能夠與環(huán)氧合酶2(COX-2)結(jié)合產(chǎn)生前列腺素PGE2，而PGE2是人體前列腺素中重要的一種，已經(jīng)被研究證實(shí)在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成、免疫抑制等多方面發(fā)揮重要作用。它可以通過G蛋白偶聯(lián)的EP信號通路激活下游MAPKs途徑中的一系列信號分子從而顯著促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。另外一方面，ω-3 PUFA(二十碳五烯酸)與環(huán)氧合酶1(COX-1)結(jié)合后產(chǎn)生PGE3，并抑制COX-2的活性，減少 PGE2的生成，抑制癌細(xì)胞侵襲能力。COX-2在許多癌癥中過表達(dá)，與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制以及高水平的PGE2產(chǎn)生密切相關(guān)。大量研究表明，抑制PGE2的產(chǎn)生及其信號級聯(lián)可以改善抗腫瘤免疫反應(yīng)的多個(gè)方面[8]。本研究發(fā)現(xiàn)Peiminine處理后人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后，其COX-2和PGE2含量明顯降低，說明Peiminine能夠調(diào)控COX-2的表達(dá)抑制PGE2的生成。與此同時(shí)，相關(guān)炎癥因子IL-6、IL-10和NF-κB的表達(dá)量也隨之受到影響。更重要的是，MAPKs途徑中EGFR信號通路中重要蛋白P-ERK、P-P53和P-P38的表達(dá)量也相應(yīng)降低。

綜上所述，Peiminine可以抑制COX-2的表達(dá)和PGE2的生成，改善抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制EGFR信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的作用。