基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討新傷濕敷液治療軟組織損傷的作用機制

劉文龍 趙靖 張喜利 常錚 劉志軍 葛金文

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)探討新傷濕敷液治療軟組織損傷的成分、靶點、通路三者之間的相互作用機制。方法 通過文獻查找及TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取新傷濕敷液活性成分，利用TCMSP及SWISS數(shù)據(jù)庫獲取對應(yīng)靶標并與Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫所獲疾病靶標交集以得到核心靶點，基于STRING平臺構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)并通過Cytoscape軟件可視化復(fù)方-藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO及KEGG可視化分析，最后將所得結(jié)果導(dǎo)入Sybyl軟件進行分子對接。結(jié)果 分析得到新傷濕敷液中活性成分作用于56個核心靶點;且分子對接結(jié)果顯示新傷濕敷液中emodin、baicalin、baicalein等成分與PIK3CA等靶點親和力強。結(jié)論 新傷濕敷液中的活性成分可能通過作用于PIK3CA等靶點以調(diào)節(jié)Th17細胞分化、TNF、IL-17等通路以治療軟組織損傷。

〔關(guān)鍵詞〕 軟組織損傷;網(wǎng)絡(luò)藥理學;新傷濕敷液;分子對接;作用機制

〔中圖分類號〕R285? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.014

〔Abstract〕 Objective Network pharmacology and molecular docking technology were utilized to explore interaction mechanisms among the components， targets and pathways of Xinshang Shifu Liquid in treatment of soft tissue injury. Methods The active ingredients of Xinshang Shifu Liquid were obtained from literature searches and TCMSP database， and corresponding targets were get from TCMSP and SWISS databases. Disease targets were retrieved via GeneCards and OMIM databases. Core targets were identified by intersecting disease targets with active ingredient action targets. Building a target interaction network based on STRING platform and through Cytoscape software to visualize the prescription-drug-component-target-pathway network. Metascapedatabase performs GO and KEGG visualization analysis on the core targets， and finally the results were imported into Sybyl software for molecular docking. Results It was analyzed that active ingredients in Xinshang Shifu liquides act on 56 core targets， and the molecular docking results showed that emodin， baicalin， baicalein and other compounds in the Xinshang Shifu Liquid have a strong affinity with PIK3CA and other targets. Conclusion The effective compounds in Xinshang Shifu Liquid may interact with PIK3CA and other targets， and regulate Th17 cell differentiation， TNF， IL-17 and other pathways to treat soft tissue injury.

〔Keywords〕 soft tissue injury; network pharmacology; Xinshang Shifu Liquid; molecular docking; mechanism of action

軟組織損傷系臨床上一種常見性、多發(fā)性病癥，常為軟組織或骨骼肌肉受到直接或者間接暴力所致，患處多表現(xiàn)出腫脹、瘀斑、疼痛、壓痛、出血、骨折、脫臼及功能障礙等癥狀[1-3]。近年來，各種意外所致的軟組織損傷發(fā)生率較高且仍呈現(xiàn)上升趨勢，軟組織損傷性病患約占據(jù)骨科、針灸科、推拿科等科室就診人次的50%～80%，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量[4]。軟組織損傷在中醫(yī)證候中屬“筋傷”范疇，因血溢脈外、瘀血留滯，以致經(jīng)脈不通、不通則痛，其本質(zhì)被認為是瘀血阻絡(luò)，治之以行氣化瘀、消腫清熱為主[5]。

新傷濕敷液為我院劉志軍教授結(jié)合其數(shù)十年臨床用藥經(jīng)驗所組方劑，在臨床上應(yīng)用多年，其消腫止痛、散瘀活血方面療效顯著。本方由鐵箍散、虎杖、千年健、紅花、尋骨風等組成[2，6]，對其研究尚處于表觀研究階段，其作用機制及分子機制尚且未知。

中藥復(fù)方因其多成分、多靶點、多通路的作用特點而難以揭示其分子作用機制[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學從藥物多種活性成分與疾病靶點相互作用整體性出發(fā)，構(gòu)建出“成分-靶點-通路”復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系以預(yù)測藥物作用于疾病的作用機制[8-10]，可為中藥診治現(xiàn)代化研究提供方法。故本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)，對新傷濕敷液中所含成分研究，分析其在軟組織損傷中的作用靶點及相應(yīng)機制，為后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1? 新傷濕敷液化學成分及靶點篩選

采用TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[11]檢索新傷濕敷液中虎杖、千年健、紅花、尋骨風的全部化學成分，根據(jù)其藥代動力學參數(shù)設(shè)置口服吸收率（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18）以篩選出活性成分，并基于其活性成分得到相應(yīng)的潛在作用靶點。此外，通過文獻檢索鐵箍散所含化學成分[12-13]，使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[14]得到其化學結(jié)構(gòu)式并導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫（http：//www.swissadme.ch/index.php），并經(jīng)Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[15]預(yù)測靶點，錄入可能性（Probability>0）的靶點。所得靶點均需經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）[16]規(guī)范后標準化其命名。

1.2? 疾病相關(guān)基因篩選

軟組織損傷以“soft tissue injury”為檢索詞在“Gene Cards”數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）[17]進行檢索，以“OMIM”數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）[18]作為補充，查找相應(yīng)軟組織損傷相應(yīng)靶點，所得靶點經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范后，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)，得到最終疾病靶點基因。

1.3? 成分靶點與疾病靶點的交集靶點獲取

將新傷濕敷液篩選出的作用靶點映射到軟組織損傷疾病靶點中，獲得新傷濕敷液治療軟組織損傷的潛在作用靶點集，構(gòu)建韋恩圖。

1.4? 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）[19]，對1.3獲得的共同靶點進行分析，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，交互作用評分為0.9，獲取靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）圖，使用Cytoscape 3.7.2軟件cytoNCA功能[20]對交集的網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，計算各節(jié)點度值、介數(shù)、最短路徑值、篩選出度值≥兩倍中位數(shù)，介數(shù)、最短路徑值≥中位數(shù)的所有靶點，即得核心靶點。

1.5? GO功能富集與KEGG通路分析

將核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/），進行GO富集分析，探討藥物作用的生物學過程;進行KEGG分析，探討藥物作用的生物通路。最后以P<0.01為具有極顯著性對數(shù)據(jù)篩選，篩選出中藥主要有效成分及藥物作用于疾病的潛在靶點與通路;將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制出“復(fù)方-藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6? 分子對接驗證

對上述新傷濕敷液中的主要活性成分和軟組織損傷核心靶基因進行分子對接，首先利用Cytoscape篩選出新傷濕敷液主要活性成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫下載其3D結(jié)構(gòu)式SDF格式，利用蛋白數(shù)據(jù)庫RCSB PDB[21]獲得解析度小于3？魡并具有配體的核心靶點蛋白，利用SYBYL軟件對包含配體的蛋白受體，進行配體篩選、去水分子、修復(fù)殘基、加氫等處理，采用 AMBER7 FF99力場能量優(yōu)化后構(gòu)建活性口袋，用Surflex-Dock模塊進行對接并得到總分值，分值越高則配體與受體的結(jié)合能力越強[22]，并將新傷濕敷液活性成分與陽性藥分子對比相應(yīng)分值，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1? 新傷濕敷液活性成分及靶點篩選

經(jīng)TCMSP平臺及文獻檢索，檢索出381個化合物，其中鐵箍散58個、紅花189個、虎杖62個、千年健45個、尋骨風27個，以TCMSP平臺OB≥30%，DL≥0.18為條件及SwissADME數(shù)據(jù)庫篩選并剔除無靶點對應(yīng)成分后得出54個活性成分，鐵箍散目前研究較少，故將其內(nèi)已發(fā)現(xiàn)活性而未符合篩選條件的成分也列入本次考察。其中polydatin、resveratrol、emodin經(jīng)文獻調(diào)研[23]為虎杖主要活性成分，然未符合篩選條件，為保證預(yù)測準確性，故仍將其納入篩選。活性成分根據(jù)其來源進行編號，共有成分以A、B、C編號并通過TCMSP及Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索得到與活性成分相對應(yīng)455個潛在作用靶點。見表1。

2.2? 疾病相關(guān)基因篩選

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫，收集軟組織損傷相關(guān)靶點基因并剔除重復(fù)值，共收集到3 991個疾病靶點基因。

2.3? 交集靶點獲取

將新傷濕敷液455個潛在作用靶點與3 991個疾病相關(guān)靶點基因經(jīng)構(gòu)建Venny圖分析，得到新傷濕敷液作用軟組織損傷330個交集靶點，其中鐵箍散62個、紅花168個、虎杖221個、千年健26個、尋骨風30個。見圖1。

2.4? 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將所得330個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限定條件為“Homo sapiens”，交互作用評分為0.9，得到蛋白間相互作用信息，進一步采用CytoNCA計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的度值、介數(shù)、最短路徑值。通過數(shù)據(jù)值得出度值中位數(shù)為11.000 0，介數(shù)為104.153 8，最短路徑值為0.063 9，故根據(jù)度值≥22，介數(shù)≥104.153 8，最短路徑值≥0.063 9為綜合篩選條件，篩選出330個交集靶點中的56個關(guān)鍵靶點（表2），進而得到PPI核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。

2.5? GO功能富集與KEGG通路分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫，分別從生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞組分（cellular component， CC）對56個核心靶點進行GO富集分析，分析核心靶點所參與的生物過程。以P<0.01為篩選條件，BP、MF、CC富集條目分別為1705、95、73條，選取前20位結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示新傷濕敷液治療軟組織損傷作用靶點參與的生物學過程為細胞因子介導(dǎo)的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控（positive regulation of transferase activity）等;分子功能主要為激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）等;膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）等細胞組分所占的比例最大。

進行KEGG信號通路富集分析獲得新傷濕敷液治療軟組織損傷的148條信號通路，對部分結(jié)果可視化處理，結(jié)果見圖3。提示新傷濕敷液治療軟組織損傷顯著影響的信號通路為Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）、T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）等，由KEGG分析可知前20條與軟組織損傷有關(guān)通路主要集中在自身免疫應(yīng)答、炎癥因子方面。

將獲得的藥物、活性成分、核心靶點、KEGG通路信息構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)圖，從多維網(wǎng)絡(luò)圖各個節(jié)點之間的相互作用關(guān)系可獲得復(fù)方-藥物-成分-靶點-通路之間的關(guān)系，結(jié)果見圖4。

2.6? 新傷濕敷液主藥有效化合物與其作用的軟組織損傷靶點分子對接

新傷濕敷液中通過Cytoscape篩選出度值≥兩倍中位值的活性成分，但篩選結(jié)果中未含鐵箍散活性成分，為保證數(shù)據(jù)的完整性，納入鐵箍散活性成分度值前兩位，故最終分析包括quercetin、luteolin、resveratrol、beta-sitosterol、emodin、baicalin、baicalein、beta-carotene、alpha-eudesmol、nerol。其在治療軟組織損傷中可能發(fā)揮重要作用，并從Drug bank搜索治療軟組織損傷非甾體藥物ketorolac作為陽性對照。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選其核心靶點度值≥60的靶標，即PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53。使用Surflex-Dock Screen與新傷濕敷液篩選所得10個主要活性物質(zhì)與陽性藥物進行對接，得到總分值。采用Sybyl-X 2.0軟件對7個關(guān)鍵靶點蛋白與11個重要成分進行分子對接驗證。完成對接模擬之后，根據(jù)關(guān)鍵藥效分子和核心靶點最低結(jié)合能值繪制熱圖。見圖5。另選取部分總分值較大的分子對接進行展示。見圖6。

結(jié)果顯示主要活性成分與核心靶標均有不同程度的結(jié)合，STAT3與MAPK1靶點僅有2組分分值大于陽性藥物，PIK3CA有7組分，AKT1、SRC、TP53則存在8組分，所有組分與MAPK3的結(jié)合分值均大于陽性藥物。故推測新傷濕敷液的主要活性成分發(fā)揮良好效應(yīng)的靶點為MAPK3、AKT1等，而在STAT3、MAPK1靶點結(jié)合較差，影響其療效的發(fā)揮。

3 討論

軟組織損傷導(dǎo)致的患處腫脹疼痛已經(jīng)嚴重地影響了患者日常生活質(zhì)量，新傷濕敷液作為湖南中醫(yī)藥大學常德附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，在骨科診室療效顯著且并未出現(xiàn)不良反應(yīng)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于軟組織損傷的臨床治療。然而新傷濕敷液治療軟組織損傷作用機制仍未進行系統(tǒng)性研究，故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)，構(gòu)建復(fù)方-藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，以探索其治療軟組織損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。

本研究通過對新傷濕敷液進行網(wǎng)絡(luò)藥理學探索，篩選出其活性成分及交集靶點，并篩選出其主要活性成分。研究[24-25]表明，上述化合物多是通過抗炎及增強免疫系統(tǒng)活性來發(fā)揮其藥理作用。其中，quercetin可抑制凝血酶和凝血因子活性，阻斷纖維蛋白的形成[26]，使血不溢脈外以消腫;luteolin可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxygen synthase， iNOS）的表達及NO、活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產(chǎn)生并激活抗氧化酶以抑制下游促炎細胞因子表達，同時下調(diào)NF-κB通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路以達到其抗炎作用[27]。resveratrol通過激活Sirtuin-1以抑制RelA乙酰化，進而下調(diào)NF-κB誘導(dǎo)的炎癥因子表達[28]。beta-sitosterol可下調(diào)肽聚糖（peptidoglycan， PGN）誘導(dǎo)的炎癥細胞因子IL-6和IL-8，并顯著降低ROS的產(chǎn)生，刺激后可誘導(dǎo)HaCaT細胞抗炎蛋白血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）的產(chǎn)生[29]。emodin可顯著下調(diào)大鼠TNF-α及iNOS蛋白表達，控制炎癥發(fā)展[30]。此外，baicalin、baicalein在特定濃度下也表現(xiàn)出對炎癥因子的調(diào)節(jié)作用[31]。beta-carotene則是通過抑制環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2， Cox2）和TNF-α發(fā)揮有效的抗炎活性[32]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選其核心靶點PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53，該類靶點度值均大于60，提示該類靶點互相作用良好并可能為新傷濕敷液主要作用靶點。PIK3CA為編碼磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）的p110α催化亞基，目前的研究多針對其與腫瘤發(fā)生、侵襲、凋亡的密切關(guān)系，然PIK3CA亦與血管新生及通透性方面起重要作用，如miR-200b可抑制PIK3CA以達到調(diào)節(jié)新生血管的形成[33]。STAT3介導(dǎo)各種細胞因子和生長因子所引起的廣泛的細胞反應(yīng)，作用涉及細胞的生長、分化、增殖、惡性轉(zhuǎn)化和凋亡、免疫調(diào)節(jié)等許多方面，目前研究表明STAT3通過其上游IL-6和TGF-β1以修復(fù)肌肉損傷及自身免疫性疾病[34]。Akt1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與炎癥過程、心血管疾病、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展。SRC是一種蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，研究[35]表明SRC激活可驅(qū)動促炎細胞因子的生成，使信號激活的SRC處于炎癥微環(huán)境之內(nèi)。MAPK1、MAPK3均歸屬于MAPK。其對炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控更為密切，可通過磷酸化NF-κB通路的IkB-α參與炎癥及細胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)[36]。TP53，系人體抑癌基因，有許多跡象表明p53蛋白在調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)中以及作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的抗原方面都發(fā)揮了作用，如引起B(yǎng)細胞抗體應(yīng)答和CD8殺傷性T細胞應(yīng)答[37]。

此外，基于KEGG富集篩選出與炎癥及免疫系統(tǒng)有關(guān)的靶點通路，其可能是新傷濕敷液消腫止痛的主要作用通路。其中Th17細胞分化，T細胞受體通路，IL-17通路、Th1和Th2細胞分化通路及B細胞受體通路均受到機體CD4 T細胞不同形式地調(diào)控，機體內(nèi)CD4 T細胞感受炎癥反應(yīng)而激活后將部分分化為Th1和Th2細胞。其中Th1細胞負責產(chǎn)生干擾素、而Th2細胞則分泌相應(yīng)因子以清除自身炎癥反應(yīng)[38]。而TNF通路參與了細胞生長、增殖、炎性及免疫等過程，當TNF通路被激活，該通路能夠相應(yīng)地誘導(dǎo)NF-κB脫離IκBα抑制而進入細胞核，從而激活下游NF-κB信號通路，并進一步促使TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子的產(chǎn)生及釋放，最終加重機體炎癥反應(yīng)[39]。同樣地，NOD受體通路的激活也將促使炎癥發(fā)生，NOD是一種重要的模式識別受體，該類受體主要表達為NOD1及NOD2，該類受體的活化也終將導(dǎo)致MAPK通路激活，表現(xiàn)形式為機體炎癥反應(yīng)加重。新傷濕敷液可通過正負調(diào)控上述通路以發(fā)揮其抗炎療效。

綜上所述，新傷濕敷液經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析及分子對接驗證，在分子生物學層次探討了新傷濕敷液治療軟組織損傷的潛在靶點及作用機制。新傷濕敷液中主要包含quercetin、luteolin、resveratrol、beta-sitosterol、emodin、Baicalin、baicalein、beta-carotene等活性物質(zhì)可能作用于PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53等靶點，以抑制炎癥反應(yīng)、消腫止痛、促進血管新生等方向治療軟組織損傷。本研究為深入探索新傷濕敷液治療軟組織損傷提供了新的思路與方法，但本文僅進行了初步預(yù)測與理論分析，具體作用機制仍需實驗手段進行深入研究驗證。

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（本文編輯? 蘇? 維）