黃芪甲苷配伍三七總皂苷對OGD/R大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及線粒體功能的影響

劉曉丹 丁煌 李艷玲 陸展輝 楊芙蓉 黃小平 鄧常清

〔摘要〕 目的 觀察黃芪甲苷（AST IV）配伍三七總皂苷（PNS）對氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）增殖、凋亡及線粒體功能的影響。方法 差速密度梯度離心法提取BMECs，免疫熒光檢測血管性血友病因子（vWF）表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，取第3代BMECs，采用AST IV與PNS高（100 μmol/L+60 μmol/L）、中（50 μmol/L+30 μmol/L）、低（25 μmol/L+15 μmol/L）劑量配伍預(yù)處理24 h，以O(shè)GD/R建立缺血再灌注損傷模型，同時設(shè)立正常組和模型組。CCK8法測定細(xì)胞增殖情況，LDH漏出率檢測細(xì)胞損傷，AnnexinⅤ/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡，TraKineTMPro活細(xì)胞線粒體染色試劑盒對線粒體進(jìn)行染色，激光共聚焦觀察線粒體結(jié)構(gòu)，JC1染色測定線粒體膜電位變化情況。結(jié)果 成功培養(yǎng)分離BMECs，陽性表達(dá)vWF，與正常組比較，模型組細(xì)胞存活數(shù)量明顯減少（P<0.05），LDH漏出率顯著增加（P<0.01），細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，AST IV與PNS不同劑量配伍均能促進(jìn)BMECs增殖、抑制LDH的釋放和抑制細(xì)胞凋亡（P<0.05，P<0.01）。與正常組比較，模型組線粒體熒光強(qiáng)度明顯降低，分布不均;與模型組比較，AST IV與PNS不同劑量配伍組深紅色熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)。與正常組比較，模型組線粒體膜電位水平下降（P<0.01），與模型組比較，AST IV與PNS不同劑量配伍組線粒體膜電位明顯增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 AST IV配伍PNS在體外能促進(jìn)缺血再灌注模型BEMCs細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，降低LDH漏出率，其機(jī)制與保護(hù)線粒體，增加線粒體膜電位有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;腦缺血再灌注;黃芪甲苷;三七總皂苷;凋亡;增殖;線粒體

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.002

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of astragaloside IV （AST IV） combined with panax notoginseng saponins （PNS） on proliferation， apoptosis， and mitochondrial function of rats brain microvascular endothelial cells （BMECs）. Methods BMECs were extracted by differential density gradient centrifugation. The cells were identified by immunofluorescence detection of the expression of von willebrand factor （VWF）. The third generation of BMECs were pretreated with AST IV combined with PNS at high （100 μmol/L + 60 μmol/L）， medium （50 μmol/L + 30 μmol/L）， and low （25 μmol/L + 15 μmol/L） doses for 24 hours. OGD/R was used to establish ischemia reperfusion injury model， and control group and model group were established at the same time. CCK8 assay was used to detect cell proliferation， LDH leakage rate was used to detect cell injury， Annexin V/PI double staining was used to detect cell apoptosis， and TraKineTMPro living cell mitochondrion staining kit was used stain the mitochondria. The structure of mitochondria was observed by confocal laser scanning. The changes of mitochondrial membrane potential were measured by JC1 staining. Results BMECs were successfully cultured and separated， and with positive expression of vWF. Compared with the control group， the number of surviving cells in the model group was significantly reduced （P<0.05）， the leakage rate of LDH was significantly increased （P<0.01）， and the apoptosis rate was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the combination of IV and PNS at different doses could promote BMECs proliferation， inhibit the release of LDH and inhibit apoptosis （P<0.05， P<0.01）; compared with the control group， fluorescence intensity of mitochondria in the model group was significantly decreased and the distribution was uneven; compared with model group， the intensity of dark red fluorescence was enhanced in AST IV and PNS groups with different doses. Compared with the control group， the level of mitochondrial membrane potential in the model group was decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the mitochondrial membrane potential of AST IV and PNS in different doses was significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion AST IV combined with PNS can promote the proliferation of ischemia reperfusion model BMECs， inhibit cell apoptosis and reduce the leakage rate of LDH in vitro. The mechanism is related to the protection of mitochondria and the increase of mitochondrial membrane potential.

〔Keywords〕 brain microvascular endothelial cells; cerebral ischemia reperfusion injury; astragaloside IV; panax notoginseng? saponins; apoptosis; proliferation; mitochondria

腦缺血性疾病的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，致殘率、死亡率很高，再灌注治療引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是繼發(fā)性神經(jīng)功能受損的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是腦微循環(huán)的重要組成部分，也是血腦屏障的組成單位，在維持血管的完整、穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要的作用。因此，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)成為腦缺血再灌注治療的重要靶點(diǎn)。

黃芪總皂苷（astragalosides， AST）和三七總皂苷（Panax notoginseng saponins， PNS）為黃芪和三七發(fā)揮心腦血管效應(yīng)的有效組分。課題組大量研究[2-11]證實(shí)黃芪甲苷（AST IV）和PNS配伍可多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并且能夠修復(fù)腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障?；诖?，本研究采用氧糖剝奪后再復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）建立體外缺血再灌注損傷模型，觀察AST主要有效成分AST IV和PNS配伍對OGD/R大鼠BMECs增殖、凋亡及線粒體功能的影響，以期為中藥有效組分配伍對腦缺血再灌注損傷后的微循環(huán)保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

健康新生5～7 d SD大鼠6只，雌雄各半，購于斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號ZS-202007210006，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SKY（湘）2013-0005。

1.2? 藥品與試劑

AST IV（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號MUST-17022804）、PNS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號MUST-17060601）購于成都曼思特生物科技有限公司;Cell Counting Kit（CCK-8）試劑盒（Biosharp生物科技公司）;LDH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）;TraKineTMPro活細(xì)胞線粒體染色試劑盒（Abbkine生物技術(shù)有限公司）;JC1線粒體膜電位檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）;vWF抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3? 主要儀器

Heracell二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Heraeusy有限公司）;FORMA3131三氣培養(yǎng)箱（美國Forma公司）;SW-CJ-1FD超凈工作臺（中國蘇凈安泰公司）;A1激光共聚焦顯微鏡（日本NIKON公司）;CYTATION5多功能酶標(biāo)成像系統(tǒng)儀（美國博騰儀器有限公司）。

2 方法

2.1? BMECs分離、培養(yǎng)及鑒定

將出生5～7 d的6只SD乳鼠用75%乙醇消毒全身后，斷頭取腦。無菌條件下于冰上剝?nèi)〈竽X皮質(zhì)，用顯微手術(shù)鑷小心撕去軟腦膜血管，用預(yù)冷PBS 液清洗 3 次后，將腦組織塊剪成1 mm3左右大小，將10 mL 0.1%的Ⅱ型膠原酶（內(nèi)含0.005% D-NaseⅠ）加入50 mL離心管中37 ℃消化30 min，每10 min上下晃動離心管3次，加入等體積DMEM-F12完全培養(yǎng)液混勻后通過100目的篩網(wǎng)，收集濾液，800×g離心10 min，棄上清，加入10 mL 20% BSA溶液分別于800×g離心10 min、1 500×g離心15 min，分別收集兩次離心底部沉淀，以大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含4 mg/L的嘌呤霉素）重懸，以接種于調(diào)整至1×106個/mL細(xì)胞密度接種于T-75培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后更換不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞完全融合后，0.25%胰酶消化傳代。

選取P3代BMECs，用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，以1×105個/mL密度接種于預(yù)先鋪有細(xì)胞爬片的12孔板中，待細(xì)胞60%融合后，吸出培養(yǎng)液，PBS沖洗3次（每次3 min），給予4%的多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，0.5% Tritonx-100室溫孵育5 min破膜，PBS沖洗3次，2% BSA常溫封閉30 min，vWF山羊抗兔一抗4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜，PBS沖洗3次，加入熒光二抗避光孵育1 h，PBS沖洗3次，含DAPI封片劑封片，激光共聚焦拍照觀察。

2.2? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs增殖的影響

根據(jù)本課題前期研究[12]結(jié)果，擬用AST IV與PNS高（100 μmol/L+60 μmol/L）、中（50 μmol/L+30 μmol/L）、低（25 μmol/L+15 μmol/L）劑量配伍作為藥物使用劑量。以缺糖缺氧2 h再復(fù)糖復(fù)氧24 h復(fù)制腦缺血再灌注損傷細(xì)胞模型。具體操作如下：選取P3代BMECs，用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，以1×105個/mL密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后，加入以大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基配制的AST IV與PNS配伍藥物，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，每孔100 μL，模型組每孔加入等體積大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，每組設(shè)立8個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;同時另鋪1塊96孔板加入等體積大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基作為正常組;處理完成后，棄培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)板更換成大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞無糖培養(yǎng)基置于N2 94%、O2 1%、CO2 5%的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，換成大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，正常組在同一時間加大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。之后取出2塊培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃避光孵育2 h，于多功能酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞相對增殖率。

細(xì)胞增殖率=（A實(shí)驗(yàn)-A對照）/A對照×100%

2.3? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs LDH漏出的影響

細(xì)胞分組及處理同“2.2”項(xiàng)，處理結(jié)束后，收集各組培養(yǎng)液，800 g/min離心10 min，取上清;同時將細(xì)胞用等量培養(yǎng)液重懸，反復(fù)凍融3次，離心取上清;按LDH試劑盒說明測定細(xì)胞培養(yǎng)液及凍融液的LDH活性，并計(jì)算出細(xì)胞LDH漏出率：

細(xì)胞LDH漏出率=培養(yǎng)液LDH活性/（培養(yǎng)液LDH活性+細(xì)胞凍融液LDH活性）×100%

2.4? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs細(xì)胞凋亡的影響

用胰酶消化P3代BMECs，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，細(xì)胞分組及處理同“2.2”項(xiàng)，處理結(jié)束后，胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，按照AnnexinⅤ/PI試劑盒要求進(jìn)行流式染色，每組設(shè)立5個復(fù)孔，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)2 000個細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

2.5? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs細(xì)胞線粒體形態(tài)及線粒體膜電位的影響

用胰酶消化P3代BMECs，調(diào)整細(xì)胞為5×104 個/mL，接種于有細(xì)胞爬片的12孔板，按照“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行分組處理。處理完成后，按照TraKineTMPro活細(xì)胞線粒體染色試劑盒及要求進(jìn)行線粒體染色，于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察。

細(xì)胞以1×105個/mL接種于96孔板，按“2.2”分組方法進(jìn)行給藥處理后，加入含終濃度為10 μg/mL JC1的無血清培養(yǎng)基，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌3次，細(xì)胞成像多功能酶標(biāo)儀下分別以495 nm和585 nm激發(fā)波長進(jìn)行掃描成像，并讀取綠色JC1單體平均熒光強(qiáng)度值和紅色JC1多聚體平均熒光強(qiáng)度值，每組設(shè)置5個復(fù)孔，以JC1多聚體平均熒光強(qiáng)度值/JC1單體熒光強(qiáng)度值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用“x±s”表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnet T3檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? BMECs鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞末貼壁內(nèi)皮細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞呈長梭形改變，7 d左右融合成致密的單層，呈“鋪路石”征象，有明顯的成管特性。

免疫熒光結(jié)果顯示：90%以上細(xì)胞胞漿有紅色熒光表達(dá)，提示細(xì)胞表達(dá)vWF因子，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。見圖1。

3.2? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs增殖的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，AST IV配伍PNS的高、中、低劑量組細(xì)胞增殖率升高。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.3? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs LDH漏出的影響

與正常組比較，模型組大鼠BMSCs LDH漏出率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，AST IV配伍PNS的高、中、低劑量組均能有效抑制LDH的漏出，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表2。

3.4? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs細(xì)胞凋亡的影響

與正常組（2.67%±0.31%）比較，模型組細(xì)胞經(jīng)OGD/R刺激后，細(xì)胞凋亡率（27.56%±1.01%）顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常組比較，AST IV與PNS高、中、低劑量配伍均可顯著抑制BMSCs凋亡（17.25%±0.84%、14.31%±0.79%、9.91%±0.57%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

3.5? AST IV配伍PNS對OGD/R大鼠BMECs細(xì)胞線粒體形態(tài)及線粒體膜電位的影響

TraKineTMPro活細(xì)胞線粒體染色結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞質(zhì)中可觀察到較多均勻分布的深紅色熒光顆粒，為著色的線粒體;模型組細(xì)胞經(jīng)OGD/R刺激后，紅色熒光顆粒明顯較少，且融合成片，提示細(xì)胞缺血再灌注損傷后，細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，形態(tài)破壞，AST IV與PNS高、中、低劑量配伍均可不同程度減輕OGD/R后的線粒體損傷。見圖3。

JC1檢查結(jié)果顯示，正常組BMECs細(xì)胞線粒體膜電位較高，聚集在線粒體基質(zhì)中的JC1熒光探針以二聚體形式存在，產(chǎn)生紅色熒光;經(jīng)OGD/R刺激后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，線粒體膜電位顯著降低，此時JC1熒光探針為單體形式，產(chǎn)生綠色熒光。與模型組比較，AST IV與PNS高、中、低劑量配伍均可降低綠色熒光比例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見圖4。

4 討論

腦缺血的病理生理機(jī)制為一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，以神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為核心假說的腦科學(xué)研究雖然取得了可觀的成績，但在臨床上的應(yīng)用卻非常有限，對多數(shù)患者來說，神經(jīng)元的死亡仍然不可避免。腦部微循環(huán)是中樞神經(jīng)血管系統(tǒng)中與其周圍組織進(jìn)行物質(zhì)代謝的結(jié)構(gòu)與成分，受血管內(nèi)外因素、血管壁結(jié)構(gòu)等的精細(xì)調(diào)節(jié)，共同維持腦部內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13-14]。血腦屏障（blood-brain barrier， BBB）是腦部微循環(huán)最重要的功能整合單位，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成BBB最重要的單元，在維持BBB結(jié)構(gòu)完整和屏障功能上起著至關(guān)重要的作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，BMECs不僅參與構(gòu)成血腦屏障，同時分泌多種細(xì)胞因子和活性物質(zhì)，維持正常微循環(huán)穩(wěn)態(tài)。因此，腦微血管內(nèi)皮保護(hù)成為腦缺血再灌注治療的重要靶點(diǎn)。

課題組前期對黃芪和三七的有效組（成）分配伍抗缺血性腦損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行了大量研究[1-10]，發(fā)現(xiàn)其可通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抗腦缺血后神經(jīng)功能損傷，最新研究發(fā)現(xiàn)[11]，其與冰片配伍可抑制缺血腦組織MMP-9表達(dá)，可能減輕腦微血管基底膜損傷，保護(hù)血腦屏障，抑制血管源性腦水腫的形成。為進(jìn)一步研究AST IV配伍PNS是否有靶向抗腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，本研究以O(shè)GD/R法建立體外腦缺血再灌注模型，研究AST IV 配伍 PNS對OGD/R模型大鼠BMECs功能的影響。結(jié)果顯示：OGD/R刺激后，BMECs細(xì)胞增殖顯著減少，凋亡明顯增加，LDH漏出顯著增加，提示腦缺血再灌注損傷可引起B(yǎng)MECs 損傷，影響其屏障功能和分泌功能。AST IV與PNS不同劑量配伍均能促進(jìn)BMECs增殖、抑制細(xì)胞凋亡、減少LDH的漏出，減輕缺血再灌注引起的BMECs損傷。

線粒體是細(xì)胞能量代謝場所，參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。線粒體膜電位是評價線粒體功能的敏感指標(biāo)，它的大小直接反映線粒體功能。TraKineTMPro活細(xì)胞線粒體染色試劑盒主要由線粒體特異性染料Mito Tracker Red熒光染料構(gòu)成，極易透過細(xì)胞膜，在活細(xì)胞中被氧化進(jìn)而發(fā)出熒光，并聚集于線粒體中，通過熒光顯微鏡觀察，可對線粒體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。本研究結(jié)果顯示：OGD/R損傷后，線粒體熒光強(qiáng)度明顯降低，分布不均，線粒體膜電位顯著降低，提示腦缺血再灌注損傷線粒體結(jié)構(gòu)和功能明顯受損，可能是引起細(xì)胞損傷和凋亡的主要機(jī)制，AST IV與PNS不同劑量配伍均能不同程度改善OGD/R模型BMECs線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，提示中藥有效組分配伍抗OGD/R模型BMECs損傷的機(jī)制可能與保護(hù)線粒體，增高線粒體膜電位有關(guān)。

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（本文編輯? 蘇? 維）