小鼠肝纖維化模型復(fù)制方法的研究進(jìn)展*

王梓睿，田飛鴻，饒木艷，姚繼紅，李華，王麗

（大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116044）

肝纖維化指由于多種病因?qū)е赂渭?xì)胞發(fā)生變性、炎癥及壞死等，進(jìn)而刺激肝細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失調(diào)，造成肝臟內(nèi)的纖維結(jié)締組織異常增生、沉積而引起的一系列病理、生理過(guò)程[1]。遺傳、代謝、炎癥、毒素、藥物及寄生蟲(chóng)等各種刺激都可以引起肝臟纖維化[2]。但無(wú)論何種病因引起的肝損傷，其纖維化過(guò)程一致，即以肝星狀細(xì)胞的活化為主要特征。肝星狀細(xì)胞活化后獲得肌成纖維細(xì)胞表型，并在肝臟分泌、沉積大量細(xì)胞外基質(zhì)[3-4]。當(dāng)肝臟損傷持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，慢性炎癥刺激和細(xì)胞外基質(zhì)的持續(xù)沉積會(huì)導(dǎo)致瘢痕組織替代正常肝臟組織，約30%肝纖維化患者逐漸發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[4]。

闡明肝臟纖維化的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)治療藥物，預(yù)防、治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，一直是治療慢性肝臟損傷的核心環(huán)節(jié)。目前肝纖維化動(dòng)物模型以多種嚙齒類動(dòng)物為主[5]，考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多為小鼠，因此越來(lái)越多肝纖維化研究用小鼠進(jìn)行模型復(fù)制。根據(jù)引起肝纖維化的原因，可將小鼠肝纖維化模型分為以下幾種類型[5]，并將其優(yōu)缺點(diǎn)綜述如下（見(jiàn)表1）。

表1 不同小鼠肝纖維化模型的優(yōu)缺點(diǎn)比較

1 膽汁淤積致肝纖維化

1.1 膽總管結(jié)扎法

膽汁淤積是急慢性肝臟疾病引起肝臟纖維化及肝硬化的主要原因之一。膽總管結(jié)扎是復(fù)制膽道梗阻性膽汁淤積肝纖維化模型最常用的方法。將8～10 周小鼠麻醉，開(kāi)腹后游離膽總管進(jìn)行雙重結(jié)扎，并在兩處結(jié)扎線間離斷，以確保膽總管完全阻斷，之后手術(shù)線縫合，關(guān)閉腹腔[6-7]。膽總管結(jié)扎后小鼠進(jìn)食量減少，皮毛散亂無(wú)光澤，行動(dòng)變少且對(duì)外界刺激（如聲、光等）的反應(yīng)減弱，尿液顏色加深，深紅帶黃，似濃茶樣改變。第15 天時(shí)，肝臟開(kāi)始明顯改變，肝臟明顯腫大，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升至正常肝臟水平的10 倍以上，經(jīng)HE 染色及天狼星紅染色后，膽總管結(jié)扎小鼠肝組織可見(jiàn)明顯改變：肝臟匯管區(qū)及膽管周?chē)渭?xì)胞腫脹、破裂、空泡變性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)表現(xiàn)明顯，門(mén)靜脈周?chē)案]周纖維化明顯[8]。膽總管結(jié)扎法復(fù)制小鼠肝纖維化模型，操作簡(jiǎn)單，成模率高，肝臟纖維化明顯，指標(biāo)穩(wěn)定，短期內(nèi)纖維化不會(huì)自行逆轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免后期感染，必要時(shí)可在術(shù)中或術(shù)后給予少量抗菌藥物預(yù)防。膽總管結(jié)扎要熟練、扎實(shí)，以防手術(shù)線脫落，膽汁或腸內(nèi)消化液流入腹腔，造成腹腔炎癥引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

1.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物法

近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)基因小鼠的研究不斷成熟，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在慢性膽汁淤積致肝纖維化和自身免疫性肝纖維化方面的報(bào)道也逐漸增多。目前已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因有Mdr2、Tgfbr2、Il2rα、Ae2a,b和NOD.c3e4等。Mdr2編碼膽小管磷脂的P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與膽汁磷脂（磷脂酰膽堿）的排泄。當(dāng)Mdr2（Abcb4）被敲除，磷脂酰膽堿向膽汁內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)不足，誘發(fā)非膿性膽管炎伴門(mén)靜脈炎，引起導(dǎo)管增生，管腔狹窄、阻塞。小鼠自出生起3～6 個(gè)月，可出現(xiàn)硬化性膽管炎合并肝纖維化及肝細(xì)胞癌[9]。原發(fā)性硬化性膽管炎系慢性膽汁淤積性肝病，以病理性免疫介導(dǎo)引起肝內(nèi)小葉間膽管炎為特征，肝內(nèi)、外膽管系統(tǒng)出現(xiàn)進(jìn)行性炎癥和纖維化。機(jī)體血清抗線粒體抗體陽(yáng)性，肝內(nèi)大膽管呈現(xiàn)節(jié)段性擴(kuò)張與縮窄，導(dǎo)致局部膽管狹窄甚至閉塞，膽管出現(xiàn)多病灶狹窄，誘發(fā)肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化[10]。在肝星狀細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)增多等過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 發(fā)揮重要作用[11]。顯性負(fù)性突變轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ受體轉(zhuǎn)基因小鼠，因CD4 啟動(dòng)子處的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ受體被抑制，其外周免疫耐受被破壞，誘發(fā)自體免疫反應(yīng)，最終引起膽管炎癥疾病。小鼠一般5～6 周發(fā)病，表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞性肝浸潤(rùn)伴門(mén)靜脈周?chē)?，肝?nèi)膽小管漸進(jìn)性損傷，與人原發(fā)性膽管炎的組織學(xué)改變相似[12-13]。此外，Il2rα、Ae2a,b敲除小鼠以及NOD.c3e4小鼠也都能誘發(fā)自身免疫病，引起廣泛的門(mén)靜脈炎癥反應(yīng)，CD4+、CD8+等浸潤(rùn)增多，均能模仿人類原發(fā)性膽管炎變化[14-16]。

1.3 免疫誘導(dǎo)法

膽管損傷也可以通過(guò)給予免疫誘導(dǎo)劑，引起小鼠自身免疫反應(yīng)，誘發(fā)免疫性膽管損傷、阻塞，引起膽汁淤積。如2-辛基酸偶聯(lián)牛血清白蛋白磷酸鹽溶液，加入含H37RA 結(jié)核分枝桿菌全弗氏佐劑充分混合后，小鼠腹腔注射給藥，8 周后可出現(xiàn)明顯改變[17-18]。

1.4 改良飼料法

通過(guò)飼喂改良后的飼料或添加劑，也可以誘導(dǎo)小鼠引起膽汁淤積肝臟損傷模型。如3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫二氫吡啶（DDC）和α-萘異硫氰酸鹽（ANIT）。每日給予小鼠含0.1%DDC 飼料，1 周后在膽管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)血管細(xì)胞黏附的表達(dá)分子、骨橋蛋白和腫瘤壞死因子-α 上調(diào)。持續(xù)8 周導(dǎo)致膽卟啉增多，膽管周?chē)〕衫w維細(xì)胞活化，引起膽道纖維化與人類硬化性膽管炎相似[19]。每日給予小鼠0.025% ANIT，飼喂數(shù)天后，就可引起膽汁淤積性損傷，引起膽管上皮細(xì)胞損傷，膽管上皮擴(kuò)張，輕度肝細(xì)胞損傷和門(mén)靜脈周?chē)装Y導(dǎo)致肝纖維化[20]。

2 毒物誘導(dǎo)致肝纖維化

2.1 CCl4

CCl4法是用于復(fù)制肝臟損傷模型的常用方法。CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷，進(jìn)一步發(fā)展即可成為纖維化模型，是較為經(jīng)典的早期肝纖維化模型復(fù)制方法。CCL4模型復(fù)制方法成熟，成功率高達(dá)89.33%，簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)安全。一般從第2 周開(kāi)始，就可出現(xiàn)不同程度肝纖維化程度，平均4.9%，至第8 周可達(dá)到平均9.2%的纖維化，能很好地模擬人類肝纖維化S0～S4 期的病理特征，且與乙肝病毒感染所致肝纖維化的病理特征相似[21-22]。該方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于研究小鼠肝纖維化發(fā)生機(jī)制、篩選血清標(biāo)志物以及開(kāi)發(fā)抗纖維化藥物等。但該方法由于CCl4處理后的肝毒性劇烈，小鼠的死亡率較高，同時(shí)還有恢復(fù)的可能?？傮w來(lái)說(shuō)，該方法在某種程度上基本可以滿足實(shí)驗(yàn)需求，同時(shí)也需要改進(jìn)來(lái)彌補(bǔ)缺點(diǎn)。

2.2 DMN

DMN 具有肝毒性，能引起肝損傷并可導(dǎo)致肝纖維化，并具有致突變和致癌性[23]。注射DMN 2 周后，就可出現(xiàn)明顯的肝纖維化（3.72%），第4 周時(shí)，肝纖維化程度為3.73%[24]。該方法操作簡(jiǎn)單，模型復(fù)制時(shí)間短，纖維化程度穩(wěn)定。但由于DMN 的毒性，該方法存在小鼠死亡率較高等弊端，同時(shí)，由于DMN 的強(qiáng)揮發(fā)性，工作人員應(yīng)注意防護(hù)。

2.3 TAA

300 mg/kg 腹腔注射TAA，2 次/周，共8 周[25]，或者將TAA 按200 mg/L 加入小鼠飲用水中，日常飲用[26]。即可見(jiàn)中心小葉壞死，轉(zhuǎn)氨酶活性升高，肝纖維化加重。該模型成功率高且穩(wěn)定，藥物中斷后肝纖維化不易恢復(fù)，但TAA 是一種弱致癌物，毒性大易揮發(fā)，使用過(guò)程中應(yīng)注意。

3 代謝性肝纖維化

長(zhǎng)期高脂飲食或以特殊飼料喂養(yǎng)小鼠，可引起肝臟脂肪樣變，引起肝臟纖維化甚至肝硬化。如小鼠以蛋氨酸-膽堿缺乏飼料喂養(yǎng)8 周后，可見(jiàn)明顯大泡性肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞呈點(diǎn)灶狀壞死以及竇周區(qū)纖維化等[27]，產(chǎn)生非酒精性脂肪肝，引起肝纖維化。此外膽堿缺乏、膽堿缺乏乙硫氨酸供給等也可引起非酒精性脂肪肝導(dǎo)致肝纖維化。

4 酒精性肝纖維化

肝臟是乙醇代謝的主要器官，在乙醇代謝過(guò)程中，肝臟NADH/NAD+比率的變化、脂肪積蓄以及脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積，均能引起肝細(xì)胞損傷。小鼠用56%乙醇自由喂養(yǎng)4～7 周，結(jié)果顯示小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性，肝臟形成纖維化[28]。該模型一般較多運(yùn)用于酒精性肝病相關(guān)研究。

5 免疫性肝纖維化

免疫性肝纖維化通過(guò)注射抗原，激發(fā)小鼠自身免疫過(guò)程，形成免疫復(fù)合物，沉降于匯管區(qū)，刺激肝星狀細(xì)胞活化，生成肌成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原沉積致纖維化。該模型是基于免疫反應(yīng)引起纖維化，故主要用于評(píng)估與分析藥物在免疫性肝纖維化中的作用與機(jī)制[8]。Con A 常用于誘導(dǎo)免疫性肝纖維化，通過(guò)激活T 細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，引發(fā)特異性肝損傷，肝實(shí)質(zhì)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞（CD4+T 淋巴細(xì)胞為主）浸潤(rùn)[29]，肝損傷進(jìn)一步發(fā)展，形成肝纖維化。Con A 誘導(dǎo)肝纖維化特征與人類病毒感染致肝纖維化病理特征更接近[30]。

此類模型是一種免疫性損傷，模型復(fù)制方法較穩(wěn)定、成功率高、對(duì)動(dòng)物其他器官損傷較輕且纖維化持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。但此類動(dòng)物免疫性肝損傷模型缺乏人類病毒感染持續(xù)復(fù)制階段以及人類肝臟實(shí)質(zhì)持續(xù)損傷的病理過(guò)程。

6 血吸蟲(chóng)致肝纖維化

血吸蟲(chóng)尾蚴可用來(lái)制備肝纖維化模型[31]。血吸蟲(chóng)尾蚴可在腸系膜靜脈系統(tǒng)發(fā)育為成蟲(chóng)，雌蟲(chóng)釋放蟲(chóng)卵進(jìn)入肝臟后，分泌可溶性蟲(chóng)卵抗原，誘發(fā)宿主機(jī)體病理性免疫應(yīng)答，繼發(fā)肝纖維化過(guò)程。感染4 周后肝臟肉芽腫增生、腫大，自第6 周開(kāi)始即可見(jiàn)中心靜脈變性壞死，門(mén)脈區(qū)結(jié)締組織增生、擴(kuò)大，肝小葉內(nèi)被增生的結(jié)締組織間隔成肝細(xì)胞團(tuán)，逐漸形成肝纖維化。此模型一般僅用于血吸蟲(chóng)病性肝纖維化及肝硬化的藥物治療研究，不適用于肝纖維化的一般研究。

7 總結(jié)

理想的肝纖維化模型應(yīng)與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展特征相似，且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)符合3R 原則，這就要求動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)該實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定、成模率高、重現(xiàn)性好。迄今為止，利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)制肝纖維化模型的方法較多，但都各有利弊。目前，尚無(wú)某一模型復(fù)制方法能完全模擬人類發(fā)病過(guò)程，這與人和動(dòng)物種屬差異大、肝纖維化致病原因復(fù)雜有關(guān)。CCl4與DMN 這兩種化學(xué)藥劑由于材料容易得到，模型復(fù)制周期短，并且無(wú)需做大量生物學(xué)上的準(zhǔn)備工作，更容易被接受。但與此同時(shí)，化學(xué)藥劑引發(fā)的肝臟反應(yīng)，并不是人類實(shí)際的發(fā)病原因。免疫模型復(fù)制方法相比于其他方法更加接近臨床情況，與人類肝纖維化情況類似，但由于誘發(fā)因子的抗原性溫和，纖維化程度都不高，動(dòng)物也沒(méi)有人類病毒感染過(guò)程中病毒持續(xù)復(fù)制以及肝臟實(shí)質(zhì)持續(xù)受損的過(guò)程。此外，我國(guó)臨床中肝纖維化的誘因仍以慢性病毒感染引起為主，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)肝炎病毒易感性低，不易成模。故未來(lái)肝臟纖維化動(dòng)物模型應(yīng)著眼于模擬人類因肝炎病毒長(zhǎng)期感染，以期對(duì)此類患者發(fā)病機(jī)制及治療藥物的篩選提供更多支持。