安石榴苷對絕經(jīng)后大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型的作用及分子機(jī)制研究

王成，黃哲璟，王揚(yáng)劍，余夢焙

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）主要臨床表現(xiàn)為 緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫大伴活動(dòng)受限，嚴(yán)重者導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾，是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的首要原因[1]。絕經(jīng)后女性，OA的發(fā)病率明顯偏高，雌激素水平下降可能是女性O(shè)A發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[2]。目前西醫(yī)主要以抗骨質(zhì)疏松藥聯(lián)合非甾體類抗炎藥、關(guān)節(jié)腔注射、功能鍛煉、理療等方式進(jìn)行對癥治療。安石榴苷（Pun）的類雌激素樣作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方面已經(jīng)得到證實(shí)[3]，對雌激素缺乏的骨質(zhì)疏松癥骨量丟失方面具有明顯抑制作用，同時(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞活性[4]。本研究探討Pun對去卵巢雌鼠OA模型的保護(hù)作用，以期為臨床OA治療提供相關(guān)參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 5月齡健康雌性SD大鼠100只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)1周后稱重，實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，自然光照，自由飲食。飼養(yǎng)溫度20～23℃，相對濕度為50%～55%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。安 石 榴 苷（Pun，百 靈 威，北 京，P840270），17 -雌二醇（阿拉丁，北京，E110147），Trizol試劑（索萊寶，北京，10296028），cDNA第一鏈合成試劑盒和2×Probe qPCR Mix試劑盒（杭州新景生物技術(shù)有限公司），MMP-1抗體（ER63978）、-actin抗體（EM21002）、TIMP-1抗體（EM2001-03）及MMP-3抗體（ER1706-77）均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，HRP偶聯(lián)抗兔二抗（CST，美國，#7074），TIMP-1、MMP-3以及IL-1 ELISA檢測試劑盒（CAT.No：70-EK3 1 3 8-2 4/7 0-a b 3 5 6 6 7-0 5 0/7 0-EK301BHS-96）均購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司，大鼠雌二醇（E2）（CAT.NO：ARG22693）/MMP-1 ELISA試劑盒（ARG21506）均購自Arigo公司，其他試劑包括乙醇和異丙醇等的分析等級購自中化試劑有限公司（上海，中國）。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建 在麻醉下經(jīng)背側(cè)第三腰椎橫突下方椎旁進(jìn)入腹腔切除大鼠雙側(cè)卵巢，止血后逐層縫合。去卵巢一周后，每天進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片和吉姆薩染色，連續(xù)5 d，以不出現(xiàn)動(dòng)情期反應(yīng)為去卵巢成功。在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)靠近髕骨處切開皮膚及關(guān)節(jié)囊，將髕骨推向外側(cè)，切斷交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，滴入少量青霉素溶液，縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，術(shù)后5 d內(nèi)給予青霉素溶液10萬U/d肌肉注射防感染。分籠飼養(yǎng)并驅(qū)趕4周加速OA發(fā)生，每周驅(qū)趕3次，每次＞60 min。挑選造模成功大鼠60只，隨機(jī)分為6組，10只/組。分為偽手術(shù)組、模型組、陽性藥組（皮下注射17-雌二醇50 g/d）、Pun低劑量組（PunLo，10 mg/kg）、Pun中劑量組（PunMed，20 mg/kg）及Pun高劑量組（PunHi，40 mg/kg）。Pun組每天灌胃給予不同劑量Pun溶液，實(shí)驗(yàn)持續(xù)16周。

1.3 大鼠足底加壓痛閾測量 將大鼠放置于金屬絲網(wǎng)墊上，用特制透明塑料籠罩住，待其適應(yīng)30 min安靜后，連接好張力測量儀器，通過小動(dòng)物生物信號采集處理系統(tǒng)（卡爾文，南京，Medlab型）進(jìn)行信息收集，對測試探針進(jìn)行張力調(diào)零后，垂直作用于大鼠足底部，在大鼠縮足時(shí)記錄電腦屏幕顯示的探針施加壓力的大小。造模前測量3次取平均值，造模之后分別在4、8、12及16周檢測大鼠足部承重壓力閾值，每只動(dòng)物每次測試間隔時(shí)間不少于30 s。

1.4 骨密度檢測 各組大鼠于灌胃12周后，每組取4個(gè)股骨標(biāo)本，在OPX-L型雙能X線骨密度測量儀（Lunar，USA，附動(dòng)物骨密度測量軟件）下掃描股骨遠(yuǎn)端，測量其骨密度值。每個(gè)標(biāo)本測量2次，取平均值。

1.5 血清雌二醇（E2）濃度及子宮指數(shù)的測定 OA造模后的第4、8、12及16周分別取大鼠血樣，離心分離后取血清，雌二醇ELISA試劑盒測定大鼠血清E2水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取子宮稱重，計(jì)算子宮指數(shù)：子宮濕重（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6 關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子檢測 造模16周之后，大鼠脫頸椎處死后，立即自膝關(guān)節(jié)注入0.9%氯化鈉注射液0.2 ml，混勻后抽取20 l關(guān)節(jié)液，使用磷酸鹽緩沖液將抽取關(guān)節(jié)液稀釋至1 ml，采用ELISA對稀釋后的關(guān)節(jié)液進(jìn)行白介素（IL）-1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1蛋白定量分析，操作方法參見說明書。每個(gè)標(biāo)本至少測定3次。

1.7 Western-Blot檢測 軟骨組織液氮研磨后加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取組織蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣本按40 g/泳道上樣，12%SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。第2天用TBST洗滌后孵育二抗。TBST洗滌后加入ECL，蛋白成像儀獲取圖像。Image J計(jì)算條帶光密度，以-actin帶為內(nèi)參，計(jì)算圖中各目的蛋白帶相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差，組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）進(jìn)行評估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pun對大鼠去卵巢OA模型痛閾、骨密度和子宮指數(shù)影響 正常雌性大鼠在5d的檢測中有出現(xiàn)動(dòng)情期，陰道分泌物中有核細(xì)胞占大多數(shù)，并可見上皮角化細(xì)胞。在去勢模型組僅見大量白細(xì)胞，罕見有核細(xì)胞及上皮角化細(xì)胞。見封三彩圖2。

圖2 大鼠去卵巢后陰道分泌物染色及OA造模后足底痛閾測試注：A：大鼠動(dòng)情期間應(yīng)道分泌物鏡下觀察（HE，×200）；B：大鼠OA造模后足底痛閾檢測波形圖

使用高劑量Pun后，OA大鼠足底承重閾值的恢復(fù)情況能達(dá)到偽手術(shù)組和陽性藥組的水平，模型大鼠足底承重閾值與Pun劑量正相關(guān)（r=0.9012，P＜0.05）；模型組BMD顯著低于偽手術(shù)組，給予Pun以后可改善BMD，并與劑量呈正相關(guān)（r=0.7692，P＜0.05），高劑量組與陽性藥物組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組子宮指數(shù)明顯低于偽手術(shù)組（P＜0.05），給予Pun后可顯著改善子宮指數(shù)（P＜0.05），并與劑量呈正相關(guān)（r=0.9009，P＜0.05）。見表1。

表1 Pun對OA大鼠痛閾、BMD和子宮指數(shù)的影響

2.2 Pun對去卵巢OA大鼠血清E2水平的影響 Pun顯著提高E2濃度，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見表2。

表2 各組雌二醇濃度 pg/ml

2.3 Pun對關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子影響模型組中IL-1分泌顯著升高，PunHi組可顯著減少炎癥介質(zhì)IL-1的表達(dá)（P＜0.01）。模型組中MMP-1、TIMP-1和MMP-3/TIMP-1的比值增加，PunHi組中比值顯著降低（P＜0.05），接近陽性藥組。見表3。

表3 炎性因子檢測結(jié)果 pg/ml

模型組MMP-1、MMP-3的蛋白表達(dá)顯著增加，而TIMP-1的表達(dá)顯著下降。Pun組MMP-1、MMP-3表達(dá)均高于模型組（均P＜0.05）。見封三彩圖3。

圖3 Western blot檢測大鼠MMP-1、MMP-3和TIMP-1表達(dá)

3 討論

OA是老年人常見的關(guān)節(jié)疾病，尚缺乏有效的治療方法，尤其是絕經(jīng)后婦女，雌激素對軟骨有明顯的保護(hù)作用。大鼠雙側(cè)卵巢切除可模擬人絕經(jīng)后的生理變化[5]。本研究在通過手術(shù)切除大鼠雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)上，切斷關(guān)節(jié)交叉韌帶，切除半月板，成功建立絕經(jīng)后OA大鼠模型。結(jié)果顯示大鼠造模后血清E2降低、Il-1上調(diào)。同時(shí)模型組大鼠在卵巢切除后4周即出現(xiàn)OA癥狀，表現(xiàn)為血清E2、子宮指數(shù)和骨密度下降，下肢關(guān)節(jié)痛閾下降等變化，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[6]。

Pun具有明確的抵抗炎癥和氧化損傷效果，被越來越多地應(yīng)用到抗衰老和心血管疾病、糖尿病和腫瘤的預(yù)防中[7]。研究顯示，Pun具有類雌激素作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上被證實(shí)[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pun在與雌激素密切相關(guān)的OA關(guān)節(jié)軟骨受損中發(fā)揮保護(hù)作用，且以劑量依賴的方式逐漸增加大鼠E2水平，并顯著增加子宮指數(shù)和骨密度，高劑量組可達(dá)到與陽性藥物相近效果。

在OA發(fā)病機(jī)制研究中，IL-1不僅可上調(diào)IL-6和其他促炎因子的表達(dá)，而且是調(diào)節(jié)軟骨分解相關(guān)基因的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-1上調(diào)可誘導(dǎo)破壞性基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)加重OA進(jìn)展[9]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清E2含量降低而關(guān)節(jié)腔中IL-1分泌顯著增加，Pun抑制IL-1的表達(dá)，可能是因?yàn)镻un給藥后誘導(dǎo)血清E2升高繼而降低炎癥介質(zhì)IL-1的表達(dá)[10]。在正常軟骨中，MMPs和TIMP-1之間是平衡的，并在維持關(guān)節(jié)軟骨的完整性方面起著重要的作用，MMPs/TIMP-1比值變化是反應(yīng)OA進(jìn)展的重要指標(biāo)[11]。研究表明，不受控制的調(diào)節(jié)和加劇的MMPs表達(dá)參與了OA的發(fā)病[12]。本研究中模型組MMP-1、MMP-3的蛋白表達(dá)顯著增加，并與OA嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。相反，TIMP-1的表達(dá)則下調(diào)，最終使得模型組中MMP-1/TMP-1和MMP-3/TIMP-1的比值顯著增加。Pun組MMP-1、MMP-3相對表達(dá)水平逐漸下調(diào)，并呈劑量依賴性。同時(shí)，Pun組TIMP-1蛋白水平略有升高。值得注意的是，高劑量Pun可以明顯地增加這兩個(gè)比值，這種影響類似于陽性藥組。這表明Pun可以減少IL-1分泌，進(jìn)而降低MMP-1/TIMP-1和MMP-3/TIMP-1在OA中的比值。

綜上所述，本研究成功建立去卵巢OA大鼠模型，并證實(shí)Pun通過提高痛閾和骨密度、降低炎性因子水平及改變骨代謝平衡，明顯緩解去卵巢大鼠OA癥狀，在絕經(jīng)后OA治療上具有一定前景。