基因芯片技術檢測分枝桿菌的臨床應用研究

孫毅，胡耀仁，孫春麗，高國生，丁源華，朱育銀，陳錦春

結核分枝桿菌復合群（MTB）導致的結核病是全球重要公共衛(wèi)生問題，我國系全球結核病和耐藥結核病高負擔國家之一。近年來非結核分枝桿菌（NTM）感染呈上升態(tài)勢，其引發(fā)的臨床表現與結核病十分相似[1]，導致在診療過程中常發(fā)生誤診。因此，在感染早期快速、準確地進行分枝桿菌菌種鑒定對于疾病的診斷、治療和控制具有重要意義?；蛐酒夹g作為新興的分子生物學技術，可在短時間內實現分枝桿菌基因突變位點的檢測，區(qū)別MTB和NTM，并快速鑒定NTM種群。本文回顧性分析中國科學院大學寧波華美醫(yī)院過去4年間應用基因芯片技術檢測痰液標本的情況，揭示MTB的耐藥狀況和NTM菌種分布情況，以期為結核及相關疾病的個體化精準治療提供指導依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2016年2月至2020年9月對1 654例患者進行了痰液基因芯片檢測，排除陰性（821例）、無法判讀者（14例）及結果不全者（127例）者，最終納入患者692例。

1.2 主要試劑與儀器 ABI StepOnePlus基因擴增儀、LuxScanTM 10K/B微陣列芯片掃描儀、BioMixerTM II芯片雜交儀、SlideWasherTM芯片洗干儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒及盒蓋若干套、晶芯MTB耐藥基因檢測試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定診斷試劑盒均由北京博奧生物集團有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因芯片檢測

1.3.1.1 痰標本處理及DNA提取 取1 ml痰標本加入等量的液化液，對痰標本進行前處理。以13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml洗液于沉淀中，混勻后繼續(xù)以10 000 r/min離心2 min，棄去上清液。向剩余沉淀中加入50 l裂解液，混勻后置于沸水10 min，以10 000 r/min離心2 min，取上清液待用。

1.3.1.2 PCR擴增 按照加樣順序準備PCR反應管，并在管蓋和管身做好相應標記；根據樣本數量分裝PCR擴增試劑1/2/3，每份樣本3個體系，分別分裝18 l；將模板DNA即上清液及對照品以2.0 l/管，加入到對應的3個反應體系的PCR管中，體系共計20 l，混勻后瞬時離心。將PCR擴增管置于PCR擴增儀中，按37℃600 s，94℃600 s；94℃30 s，60℃30 s，72℃40，熱循環(huán)35次；94℃30 s，72℃60 s，熱循環(huán)10次；72℃420 s進行PCR擴增反應。

1.3.1.3 芯片雜交 從試劑盒B中取出雜交緩沖液，50℃溫浴使其完全融化；將PCR產物置于PCR儀中95℃變性5 min，隨后立即置于冰水混合物中至少3 min；按照9 l雜交緩沖液，3 l+3 l PCR產物的比例配制雜交混合物。按照雜交盒（在雜交盒溝槽中加入200 l純化水），托架，芯片，蓋片的順序裝配好雜交反應盒；吸取13.5 l雜交混合物經加樣孔加入芯片點陣中，注意不要將氣泡加入反應池中，蓋好盒蓋并用金屬條密封雜交盒；50℃預熱BioMixerTMII芯片雜交儀20 min以上，完成后將雜交盒平穩(wěn)放入雜交儀托盤，并注意將3只或6只雜交盒全部放入，以使托盤平衡；運行結核耐藥基因檢測芯片雜交程序，雜交條件為50℃雜交2 h，轉速為5 r/mim。

1.3.1.4 洗滌干燥 使用20×SSC，10%SDS，根據需要及實際情況，按如下比例配制洗滌液Ⅰ和Ⅱ。洗滌液I：依次將純化水，20×SSC，10%SDS按照88∶10∶2的比例配置；洗滌液II：依次將純化水，20×SSC按照99∶1的比例配置；預熱SlideWasherTM芯片洗干儀，待儀器屏幕顯示“請放入芯片進行洗滌”時即可放入完成雜交的芯片，運行MTB耐藥基因檢測芯片洗滌程序進行洗滌，儀器屏幕顯示“請將芯片放入甩干倉”時，表示洗滌已經完成，即可將芯片對稱的放入甩干倉，點擊確定開始甩干。

1.3.1.5 掃描判讀 使用晶芯Lux-ScanTM 10 K/B微陣列芯片掃描儀和晶芯MTB耐藥檢測芯片判別系統(tǒng)進行信號讀取及結果判斷。

1.3.2 分枝桿菌菌種鑒定 嚴格按照分枝桿菌菌種鑒定診斷試劑盒說明書對菌種進行鑒定，包括MTB復合群與NTM的17個種或群（胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌等）。

1.4 統(tǒng)計方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數資料比較采用2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因芯片檢測結果 MTB 514例（74.17%），NTM 178例（25.69%）（其中97例進行了種群分析）。

2.2 MTB的耐藥情況 514例MTB中，兩藥均敏感占80.35%，單耐利福平、單耐異煙肼、耐多藥（利福平和異煙肼）分別占4.47%、4.86%、10.31%。初治組兩藥均敏感的比例高于復治組（P＜0.05），而復治組單耐利福平和耐多藥比例高于初治組（均P＜0.05）。見表1。

表1 MTB的耐藥情況 例（%）

2.3 不同性別、年齡MTB患者的耐藥情況 MTB患者以男性和40歲以上人群為主，分別占比72.96%、68.29%。不同性別和年齡組患者的耐藥率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同性別、年齡MTB患者的耐藥情況 例（%）

2.4 MTB對利福平和異煙肼相關耐藥基因突變位點分布 單耐利福平ropB突變位點以531（C→T）和526（A→G）為主，均為單一位點突變；單耐異煙肼突變位點以KatG基因315（G→C）為主，均為單一位點突變。耐多藥中雙位點突變46例（86.79%），3位點突變6例（11.32%），5位點突變1例（1.89%）。突變頻率最高的是531（C→T）/315（G→C），見表3～4。

表3 單耐利福平和異煙肼相關耐藥基因突變位點分布

2.5 NTM菌種分布情況 97例NTM中種群達7種，以胞內分枝桿菌（38.14%）、鳥分枝桿菌（31.96%）和龜/膿腫分枝桿菌（16.49%）為主，見封三彩圖1。

圖1 NTM菌種分布情況

3 討論

基因芯片是通過微陣列技術將大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，檢測利福平rpoB、異煙肼katG和inhA等多個突變位點，以便快速檢測兩種一線藥物的耐藥性。此外，該法還可以快速檢測多種臨床常見NTM。

本研究結果顯示，MTB患者利福平/異煙肼的耐藥率為19.65%，與陜西省西安市報道的19.52%結果較為一致[2]，但低于新疆阿克蘇地區(qū)報道的34.9%[3]。這說明地域差異可能是肺結核患者利福平/異煙肼耐藥率不同的影響因素之一。復治組耐利福平和異煙肼兩藥的比例（28.23%）高于初治組（4.62%），均略高于2014年WHO結核病的報告結果（初治病例占3.3%，復治病例占20.0%）[4]；同時耐兩藥率高于浙江省水平（3.46%）[5]。這說明本地區(qū)MTB耐藥情況較為嚴重。復治患者耐多藥率較高的原因：（1）由于病情遷延不愈導致機體抵抗力較差；（2）長期治療，醫(yī)囑依從性下降；（3）復治患者可能存在濫用藥物、不規(guī)范治療。

表4 耐多藥（利福平和異煙肼）的基因突變位點分布

同時，本研究發(fā)現肺結核患者中男性占比高于女性患者，＜20歲的患者比例最低，而≥60歲的占比最高，且患者比例隨著年齡升高而增加，但不同性別和年齡組的肺結核患者耐藥率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。這說明老年男性是MTB感染的主要人群，與安徽省阜陽地區(qū)的結論一致[6]。這可能與老年人群抵抗力差、合并糖尿病和高血壓等并發(fā)癥有關。需要指出的是，本地區(qū)＜20歲組人群的耐藥率最高（33.33%），與既往文獻報道不同[7]，這可能與樣本量較小導致的分析偏倚有關，確切結論需要擴大樣本量進行深入的探討。

MTB對利福平和異煙肼相關耐藥基因突變位點分布結果顯示，單耐利福平ropB突變位點以531（C→T）為主，單耐異煙肼突變位點以KatG基因315（G→C）為主，耐多藥突變頻率最高的是531（C→T）/315（G→C），這與既往結果基本一致[7-8]，而其他突變位點分布略有不同，考慮系區(qū)域差異及標本量不同所致。

近年來NTM感染的發(fā)病率和患病率呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。由于NTM的臨床表現與結核相似，使得臨床上常常發(fā)生誤診。鑒于兩者的治療方案差異較大，因此對分枝桿菌進行菌種鑒定至關重要。本研究NTM感染率占25.69%，高于徐州地區(qū)[9]。NTM種群以胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌為主，與龍巖市一致[10]，而與長沙市略有不同[11]。

綜上所述，基因芯片技術可作為臨床分枝桿菌感染診斷的重要檢測手段，目前本地區(qū)MTB耐藥和NTM感染形勢較嚴峻，應加強監(jiān)測和防控工作。