丹參飲預處理對缺血/再灌注損傷大鼠心肌細胞的保護作用及對血漿氧化三甲胺水平的影響

任耀龍，鄭 剛，趙明君，楊 磊，鐘 偉，齊 婧，劉東敏，徐佳萌，尤金枝，李瑩超

急性心肌梗死是常見的嚴重威脅人類生命安全的心血管系統(tǒng)急危重癥，臨床治療的首要任務是盡快開通罪犯血管，恢復心肌血流灌注。然而，伴隨而來的心肌缺血/再灌注損傷嚴重制約了病人臨床獲益[1]。腸道菌群被稱為“人體元基因組”，與宿主之間存在密切的信息交流，在代謝、免疫、心血管系統(tǒng)方面的調控發(fā)揮著重要作用[2]。氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)是食物中膽堿、卵磷脂、左旋肉堿等經腸道菌群作用后產生的代表性代謝產物，可促進冠心病發(fā)病及不良主要心血管事件發(fā)生[3]。丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛等功效，主治心痛、胃脘諸痛，已廣泛用于冠心病及消化系統(tǒng)疾病的臨床治療，并取得確切的臨床療效[4-5]?；诖?，提出丹參飲調控腸道菌群保護心肌缺血/再灌注損傷的學術假說，本研究觀察丹參飲預處理對SD大鼠在體心肌缺血/再灌注模型腸道菌群的代表性代謝產物TMAO和血清心肌酶、N末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)及心肌組織形態(tài)學的影響，探討中醫(yī)經典名方丹參飲對缺血/再灌注心肌細胞的保護作用及對模型動物血漿TMAO水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇無特定病原體(SPF)級健康成年SD大鼠50只，雌雄各25只，體質量180～210 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(川)2015-030。實驗動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級動物實驗中心，給予標準飼料及飲用水喂養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.2 實驗藥物與試劑 實驗用丹參飲由丹參15 g、檀香15 g、砂仁10 g組成，實驗藥物均購自陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中草藥房。藥物制備：精確稱取生藥40 g，加12倍自來水，浸泡30 min，按質量/體積=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)后，藥液以1 000 r/min離心10 min除雜質，濃縮為含生藥量1 g/mL，4 ℃下密封冷藏備用。肌酸激酶同工酶(CK-MB)和NT-proBNP試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號：20191231]，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191228)，甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 實驗儀器 PL3508/P八通道研究型高速記錄系統(tǒng)；SC-5型小動物呼吸機；Bio-Tek ELXSOSIU型全自動酶標儀；CR22GⅡ型高速冷凍離心機；Leica VT1000 S振動切片機；TC-120S+生物組織自動脫水機；TR-180生物組織自動染色機；Nikon TS100-F(配DS-5MC)IX73-U型倒置熒光數(shù)碼顯微鏡；MS105DU半微量電子天平；Direct-Q⑤5純水/超純水一體機系統(tǒng)；D3024R高速微量冷凍離心機；JP-040S超聲波清潔器；MX-F旋渦振蕩器；MTV-100多管旋渦混合儀；TSQ Quantum三重四極桿質譜儀；UlitMate3000rs色譜儀；0.5～10.0 μL、2.0～20.0 μL、20.0～200.0 μL、200.0～1 000.0 μL移液器。

1.4 TMAO檢測方法及條件 從含EDTA的全血中分離出1 mL血漿，置于-80 ℃冰箱凍存待檢。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)測定血漿TMAO濃度。質譜條件，離子源：電噴霧電離源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應監(jiān)測；電噴霧電壓4 000 V；毛細管溫度350 ℃；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%)；鞘氣：氮氣(純度≥99.999%)，40 Arb；輔助氣：氮氣(純度≥99.999%)，15 Arb；數(shù)據(jù)采集時間5 min。色譜條件如下，色譜柱：Waters T3 150×2.1 mm，3 μm，Waters；流速：0.3 mL/min；水相：0.1%甲酸/10 mmol/L甲酸銨；有機相：0.1%甲酸/乙腈；柱溫箱溫度：40 ℃；自動進樣器溫度/體積：8.0 ℃/5 μL。取血漿50 μL，加入甲醇150 μL，渦旋混勻10 min，以15 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析?；衔锷V圖采集和積分運用軟件Xcilabur 3.0(Thermo)進行處理，以1/X2為加權系數(shù)進行線性回歸。

1.5 動物分組及給藥 將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組及丹參飲低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，雌雄各5只。給藥方案，假手術組：給予等體積生理鹽水每日2次，連續(xù)灌服14 d后手術，只穿線不結扎冠狀動脈；模型組：開胸結扎前降支，余同假手術組；丹參飲低劑量組(5 g/kg生藥量)、中劑量組(10 g/kg生藥量)、高劑量組(15 g/kg生藥量)，各組均配制成10 mL/kg藥液，每日2次，連續(xù)灌服14 d后手術。

1.6 動物模型制備 實驗動物模型制備參考文獻[6]并進行改進，具體操作方法：大鼠實驗前12 h禁食不禁水，將10%水合氯醛以3.5 mL/kg劑量腹腔注射實施麻醉后仰位固定于動物解剖臺上，正確連接Medlab信號采集系統(tǒng)，監(jiān)測Ⅱ導聯(lián)心電圖，氣管切開行氣管插管，連接小動物呼吸機(潮氣量2.5 mL，呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2)，觀察穩(wěn)定5 min后于胸骨左緣約0.5 cm處開胸，剪斷第4肋，刺破胸膜充分暴露心臟，剪開心包后將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動脈圓錐交界處高位以0號手術線縫針穿過前降支，同時將直徑1 mm的聚乙烯管置于手術線與前降支之間，拉緊手術線使聚乙烯管壓迫前降支造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖ST段抬高>0.1 mV為結扎成功。心肌缺血45 min后去除聚乙烯管恢復前降支灌注，以心臟表面顏色轉紅，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功，再灌注180 min后腹主動脈取血，并快速摘取心臟用于心肌組織樣本檢測。假手術組手術過程與模型組相同，但只穿線不結扎冠狀動脈。

1.7 血液標本采集 再灌注3 h后于腹主動脈取血，血液標本以3 000 r/min離心后取上清液分裝，置于-80 ℃冰箱冷凍備用，實驗全部結束后嚴格按照試劑盒操作測定血清LDH、CK-MB、NT-proBNP及TMAO等生化指標。

1.8 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理變化 采血后快速摘除心臟，取缺血心肌組織，置于10%甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后進行光學觀察，采集圖像進行分析。

2 結 果

2.1 大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型各階段心電圖表現(xiàn) 本研究詳細記錄了整個實驗過程各組大鼠心電圖表現(xiàn)。詳見圖1。

圖1 心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠各階段心電圖(A為結扎大鼠前降支，心電圖表現(xiàn)為ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；B為45 min后取出聚乙烯管給予前降支再灌注，出現(xiàn)再灌注后室性心律失常及Q波；C為再灌注180 min后心電圖表現(xiàn)為ST段回落，病理性Q波形成)

2.2 各組大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與丹參飲低劑量組比較，丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與丹參飲中劑量組比較，丹參飲高劑量組血清CK-MB、LDH與NT-proBNP水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與假手術組比較，模型組及丹參飲預處理組血漿TMAO表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，丹參飲預處理組TMAO表達均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠CK-MB、LDH、NT-proBNP及TMAO水平比較(±s)

2.3 對心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織病理學的影響 對大鼠缺血區(qū)心肌進行HE染色，觀察各組心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞形態(tài)學改變，結果顯示：模型組心肌紋理紊亂，心肌細胞正常結構明顯被破壞，丹參飲預處理組可明顯改善這一病理表現(xiàn)，并隨著丹參飲劑量增加，改善作用明顯增強。詳見圖2。

圖2 心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織HE染色圖

3 討 論

隨著人口老齡化程度加劇和居民生活水平的提高，我國心肌梗死發(fā)病率呈升高趨勢，已成為威脅人民生命安全的重大公共衛(wèi)生問題?！吨袊难懿蟾?018》數(shù)據(jù)顯示：我國每年有29.5萬人次因心肌梗死住院，2017年我國急性心肌梗死住院總費用高達190.85億元，嚴重影響國民生活質量，增加了病人的經濟負擔[7]。心肌梗死的臨床救治以盡早開通罪犯血管，及時恢復冠狀動脈血流為目標。然而，恢復血流后的心肌缺血/再灌注損傷進一步加大心肌梗死面積，誘發(fā)惡性心律失常，降低心功能，是心血管研究領域亟待解決的問題之一。

近年來，國內外學者針對心肌缺血/再灌注損傷的具體生理病理機制開展了大量研究，一般認為心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生與細胞凋亡、心肌能量代謝障礙、內皮細胞功能障礙、氧自由基暴發(fā)、細胞內鈣超載、中性粒細胞浸潤等有關[8]，但確切的病理生理機制尚不清楚。有研究顯示，腸道菌群的典型代謝產物TMAO與動脈粥樣硬化形成有關，急性冠脈綜合征病人血漿TMAO水平明顯增高[9]。血漿TMAO含量升高與急性冠脈綜合征病人主要不良心臟事件(如心肌梗死、腦卒中、需要血運重建)呈正相關[10]。由此可見，血漿TMAO可能是心肌梗死的潛在治療靶點。

目前，中醫(yī)藥廣泛應用于心肌缺血/再灌注損傷的防治，藥理學已證實，多種中藥單體及中藥復方針對心肌缺血/再灌注損傷可有效減少心肌凋亡，減輕心肌細胞線粒體損傷，調控自噬過程，調節(jié)內源性一氧化氮表達，抑制炎癥反應，多角度發(fā)揮心肌細胞保護作用[11]。丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，主治心痛及胃脘諸痛，廣泛用于心血管系統(tǒng)及消化系統(tǒng)疾病的臨床治療，是治療心肌梗死的常用經典基礎方劑之一，并取得滿意的臨床療效。因此，從腸道菌群角度出發(fā)，提出丹參飲通過調控腸道菌群改善缺血/再灌注心肌損傷的學術假說，采用丹參飲預處理心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠，探討丹參飲對心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細胞保護作用及對實驗動物腸道菌群代表性代謝產物TMAO水平的影響。

本研究采用前降支結扎方法制備大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，研究過程可觀察到典型的急性心肌梗死心電圖演變過程，部分大鼠再灌注階段記錄到典型的室性心動過速心電圖表現(xiàn)，說明造模成功。本研究結果顯示，與模型組比較，丹參飲預處理組血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平均降低(P<0.01)，且隨著丹參飲濃度遞增該表現(xiàn)更顯著，說明丹參飲預處理可顯著降低心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌酶學水平，保護心功能，且高濃度丹參飲保護作用更顯著。同時對實驗大鼠缺血區(qū)域心肌細胞進行HE染色，觀察心肌細胞形態(tài)學改變，結果還顯示：模型組心肌紋理紊亂，心肌細胞正常結構明顯被破壞，丹參飲預處理可明顯改善這一病理表現(xiàn)，且隨著丹參飲劑量增加，改善作用明顯增強，從病理學角度說明丹參飲預處理保護心肌缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細胞的作用。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組與丹參飲預處理組血漿TMAO水平明顯增高，說明結扎前降支可明顯促進模型動物血漿TMAO表達，從動物實驗角度進一步證實TMAO與心肌梗死的相關性；但丹參飲預處理組與模型組大鼠血漿TMAO水平比較均無明顯變化，說明丹參飲預處理不能降低缺血/再灌注損傷模型大鼠血漿TMAO水平。

綜上所述，本研究從心肌酶學及病理組織學角度明確丹參飲預處理對缺血/再灌注損傷心肌具有確切的保護作用，并可較好地保護心功能，但不能降低血漿TMAO水平。本研究從中藥復方調控腸道菌群角度出發(fā)，探討丹參飲保護缺血/再灌注損傷心肌的臨床效應機制，為中醫(yī)藥防治心肌缺血/再灌注損傷開拓了新思路與新方法，今后將以腸道菌群為治療靶點開展中藥單體及中藥復方防治心血管病的基礎與臨床研究，為中醫(yī)藥調控腸道菌群防治心血管疾病提供可靠的數(shù)據(jù)支撐和臨床證據(jù)。