伊伐布雷定對病毒性心肌炎大鼠Bcl-2基因啟動子區(qū)甲基化及mRNA表達的影響

陳小霞，程齊堯，詹 磊，蔣 磊

心肌炎是心肌局限性、彌漫性的急性、慢性炎性病變，可由多種因素誘導(dǎo)發(fā)病，分為非感染性心肌炎和感染性心肌炎，病毒感染是常見的病因，其次是細菌、真菌、病原體等[1]。病毒性心肌炎是指病毒侵犯心肌組織引起急性、慢性心肌炎性病變，其中柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是誘發(fā)病毒性心肌炎的常見病毒，占30%～50%，病毒侵犯對心肌組織造成直接損傷，引起心肌細胞變性和壞死，影響心肌組織功能[2]。病毒性心肌炎目前尚無特異性治療方案，主要采取對癥治療，包括抗病毒治療、免疫治療、強心和利尿治療等，以減輕心臟負荷為治療原則[3]。臨床常用的β-受體阻滯劑可幫助病毒性心肌炎病人減慢心率，以達到改善病毒性心肌炎病人預(yù)后，但β-受體阻滯劑可產(chǎn)生負性肌力作用和抑制傳導(dǎo)系統(tǒng)，使用過程中可能加重病人心功能損傷[4]。伊伐布雷定屬于選擇性、特異性竇房結(jié)If通道阻滯劑，降低心律同時不影響心肌收縮力和心臟的傳導(dǎo)能力，2015年已在我國獲批上市用于心力衰竭的治療[5]。相關(guān)研究表明，伊伐布雷定在冠心病[6]、心力衰竭[7]、心絞痛[8]等疾病中表現(xiàn)出心臟保護作用，有研究表明，伊伐布雷定治療病毒性心肌炎患兒的臨床療效顯著[9]，但伊伐布雷定治療病毒性心肌炎的作用機制尚未明確。本研究通過制備病毒性心肌炎大鼠模型探討伊伐布雷定對病毒性心肌炎作用機制，以期為臨床治療病毒性心肌炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量(160±10)g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)[SCXK(粵)2019-0047]，購回后于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，晝/夜各12 h，全天自由飲水、進食。本實驗通過我院動物倫理委員會批準(zhǔn)，遵守“3R”原則。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 實驗試劑 CVB3(武漢大學(xué)病毒研究所)，伊伐布雷定(YJ-26039R，上海雅吉生物科技有限公司)，肌紅蛋白(Mb)試劑盒(0-027530，上海江萊生物科技有限公司)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶(lactate dehydro-genase，LDH)活力檢測試劑盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，RNAprep pure細胞試劑盒與Reverse Transcriptase Kit(天根生化科技北京有限公司)，2×HSYBR qPCR Mix(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，動物組織DNA抽提純化試劑盒(104-201，南京萊富賽生物科技有限公司)，EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005，上海復(fù)申生物科技有限公司)，Go Taq Green Master Mix(M7122，南京賽泓瑞生物科技有限公司)。

1.2.2 實驗儀器 SelectspinTM17R冷凍離心機(美國Select BioProducts公司)，ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析儀(美國Bio-rad公司)，LightCycler?96實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)。

1.3 制備病毒性心肌炎大鼠模型 將75只SD大鼠隨機均分為對照組、模型組、伊伐布雷定低劑量組、伊伐布雷定中劑量組、伊伐布雷定高劑量組，參考文獻[10]制備病毒性心肌炎大鼠模型，模型組和伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠腹腔注射0.1 mL 100 TCID 50與0.1 mL CVB3稀釋液，對照組注射等體積磷酸鹽緩沖液，連續(xù)注射3 d。

1.4 藥物干預(yù) 首次注射CVB3后24 h，根據(jù)伊伐布雷定臨床用藥劑量(每日5～14 mg)、成人與大鼠藥物用量折算系數(shù)(6.25)設(shè)置伊伐布雷定劑量4 mg/kg、8 mg/kg、12 mg/kg分別作為伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組干預(yù)劑量，采取灌胃方式，每日1次，對照組和模型組灌胃等體積磷酸鹽緩沖液，連續(xù)干預(yù)2周。末次給藥24 h后，股動脈取血進行心肌損傷標(biāo)志物水平檢測，取部分心臟組織用于蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察心肌病理結(jié)構(gòu)變化和脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡指數(shù)，余下心臟組織用于實時熒光定量PCR和甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心肌損傷標(biāo)志物檢測 隨機選取6只大鼠，取股動脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液儲存于-80 ℃，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測CK-MB、Mb、cTnI、LDH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 HE染色檢測心肌組織病理情況 每組隨機選取6只大鼠，取心臟組織固定于10%甲醛中性溶液，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟、水化、HE染色、脫水、透明、中性樹膠封片后在高倍鏡下(400倍)觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.5.3 TUNEL檢測心肌組織凋亡情況 常規(guī)石蠟包埋、切片至水化操作同1.5.2，采用蛋白酶K修復(fù)20 min，3% H2O2室溫封閉5 min，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)于37 ℃條件下反應(yīng)1 h，氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作溶液反應(yīng)30 min、0.05%二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色4 min、蘇木精復(fù)染10 min、脫水、透明、封片，顯微鏡下采集圖像。細胞核表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒是凋亡陽性細胞，在高倍鏡下(400倍)隨機選取5個不重疊視野，記錄視野中細胞總數(shù)和凋亡陽性細胞數(shù)量，計算細胞凋亡指數(shù)，細胞凋亡指數(shù)=凋亡陽性細胞數(shù)量/細胞總數(shù)×100%。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平 通過RNAprep pure細胞試劑盒提取心肌組織總RNA，Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄生成第一條cDNA鏈用于實時熒光定量PCR擴增，以U6作為內(nèi)參基因，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、40個循環(huán)，62 ℃ 1 min。收集熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值輸出，采用2-△△Ct公式計算Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相對表達量，再進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。Bcl-2：正向引物5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，反向引物5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′；Bax：正向引物5′-CAGTTGAACTTCCCATCAGC-3′，反向引物5′-CAGTTCAAGTTC CCATCAGC-3′；CytC：正向引物5′-TGATCCTTTGTCGTGTTGACCAG-3′，反向引物5′-GACCATGGAGGTTTCGTCCAGT-3′。所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5.5 MSP檢測Bcl-2啟動子區(qū)甲基化 以DNA抽提純化試劑盒提取心肌組織DNA，并通過分光光度測定DNA濃度，DNA總量取500 pg，采用無菌去離子水將DNA體積補足至20 μL，加入CT轉(zhuǎn)化試劑130 μL、98 ℃孵育10 min、64 ℃孵育150 min，10 μL溶解液洗脫DNA，4 ℃保存20 h。采用Methptimer軟件設(shè)計Bcl-2外引物、MSP引物，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit說明書進行操作，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，退火溫度51 ℃→41 ℃(每個循環(huán)降低0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)，之后再以第一次PCR產(chǎn)物作為擴增模板，使用Bcl-2甲基化引物、非甲基化引物進行第2次擴增，擴增條件同上。Bcl-2外引物：正向引物5′-GTTTTGTTTTTATTTATTTAGTAGTTTTT-3′，反向引物5′-AATCCTATAATATTTTCCCCTTCTC-3′；Bcl-2甲基化引物：正向引物5′-GTTTTCGTTTTCGGTTTTTTTATC-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCGAC-3′；Bcl-2非甲基化引物：正向引物5′-TTTTTGTTTTTGGTTTTTTTATTGT-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCAAC-3′。將獲得產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 V，25 min)，采用凝膠成像系統(tǒng)測量Bcl-2甲基化和Bcl-2非甲基化條帶的相對灰度值，將Bcl-2甲基化/非甲基化比較作為Bcl-2啟動子區(qū)DNA甲基化水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平比較 模型組CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平高于對照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平低于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組心肌損傷標(biāo)志物水平比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織病理HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：模型組心肌組織存在明顯炎性浸潤、細胞壞死；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌組織損傷較模型組得到明顯改善。詳見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色圖像(×400)(A為對照組；B模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

2.3 伊伐布雷定對病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡的影響 模型組心肌組織細胞凋亡指數(shù)、Bax mRNA、CytC mRNA高于對照組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA低于對照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌組織細胞凋亡指數(shù)、Bax mRNA、CytC mRNA低于模型組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平高于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見圖2、表2。

圖2 各組心肌組織TUNEL圖(×400)(A為對照組；B為模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

表2 各組凋亡指數(shù)和Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相對水平比較(±s)

2.4 各組Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平比較 MSP檢測結(jié)果顯示：模型組Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平高于對照組(P<0.05)；伊伐布雷定低劑量組、中劑量組、高劑量組Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平低于模型組(P<0.05)，且呈劑量效應(yīng)(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 各組Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化電泳圖(M為甲基化；U為非甲基化；A為對照組；B為模型組；C為伊伐布雷定低劑量組；D為伊伐布雷定中劑量組；E為伊伐布雷定高劑量組)

表3 各組Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平比較(±s)

3 討 論

心肌炎是伴有心肌炎癥和損傷的心臟疾病，CVB3是引起病毒性心肌炎發(fā)病的常見病因[11]。病毒進入機體后，直接產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)、病理性免疫反應(yīng)或引起機體產(chǎn)生自身免疫效應(yīng)。CVB3與其受體結(jié)合后，釋放病毒蛋白酶可切割宿主細胞中的各種蛋白質(zhì)，如切割Bcl-2家族中的Bid，促進心肌細胞凋亡。CVB3感染后通過蛋白酶體依賴性途徑誘導(dǎo)細胞周期蛋白D切割，引起宿主細胞生長停滯[12]。病毒感染、心肌細胞壞死引起細胞內(nèi)抗原釋放，導(dǎo)致自身免疫性T細胞活化，加重病毒性心肌炎心肌損傷[13]。病毒性心肌炎引起心率加速，心率加速可增加心血管疾病病人死亡風(fēng)險，同時心率加速也受到體內(nèi)炎癥嚴(yán)重程度的影響[14]。因此，病毒性心肌炎臨床治療時需給予減慢心率的藥物治療。伊伐布雷定是竇房結(jié)If電流選擇特異性抑制劑，延長竇房結(jié)自動去極化時間以緩解心率過快[15]，且對心肌收縮力和心臟傳導(dǎo)能力無影響。已有研究表明，伊伐布雷定對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有緩解作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平升高，通過伊伐布雷定干預(yù)后可降低病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平，且表現(xiàn)為劑量效應(yīng)。LDH為糖原溶解酶，組織細胞受損時，LDH含量升高。CK-MB是心肌組織損傷標(biāo)志物，其水平異常升高與心肌組織受損嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。肌鈣蛋白是分布于心肌細胞纖維上的一種調(diào)節(jié)蛋白，cTnI是肌鈣蛋白亞單位之一，正常生理狀態(tài)下cTnI以結(jié)合形式分布于肌原纖維，極少數(shù)cTnI分布于細胞胞漿，心肌細胞膜受損時cTnI通過心肌細胞膜進入血液循環(huán)系統(tǒng)，此時血液cTnI含量升高[18]。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織細胞斷裂明顯、細胞排列紊亂且細胞核固縮；伊伐布雷定干預(yù)后病毒性心肌炎大鼠心肌組織細胞核固縮癥狀減輕且細胞排列較緊密，說明CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎大鼠心肌組織存在嚴(yán)重損傷，給予伊伐布雷定干預(yù)可有效緩解病毒性心肌炎大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果還顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)升高，給予伊伐布雷定干預(yù)可降低心肌組織凋亡指數(shù)，說明伊伐布雷定可減少病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡。細胞凋亡是病毒性心肌炎性細胞死亡的作用機制之一，病毒性心肌炎急性期，心肌組織存在細胞凋亡，這些凋亡細胞主要是浸潤于局部心肌組織的炎性細胞，隨著病毒性心肌炎病情進展，心肌細胞和心肌纖維化細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡的發(fā)生主要有3種途徑，包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑。Bcl-2主要分布于線粒體膜外，具有調(diào)節(jié)線粒體膜通透性作用，Bax是線粒體膜成分之一，Bax表達上調(diào)促進CytC穿過線粒體膜進入胞質(zhì)，激活細胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族在線粒體外膜通道形成過程中發(fā)揮重要作用，其中促凋亡蛋白Bax可在線粒體外膜產(chǎn)生釋放孔道，有助于膜間隙中的可溶性蛋白經(jīng)過此孔道進入細胞質(zhì)，正常生理狀態(tài)下不影響線粒體內(nèi)膜功能和基質(zhì)功能[20]。受到凋亡信號刺激時，Bax構(gòu)象發(fā)生變化并寡聚在線粒體膜上，形成較大孔道，將CytC從線粒體中釋放，Bcl-2可降低線粒體膜通透性，抑制CytC釋放[21]。CytC是電子傳遞鏈復(fù)合體中的組成部分之一，具有傳遞電子作用，定位于線粒體膜間隙，電穩(wěn)定性結(jié)合于線粒體膜，受到凋亡信號刺激時，經(jīng)孔道進入細胞質(zhì)，之后在系列作用下形成凋亡體，活化Caspase途徑，促進凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，病毒性心肌炎大鼠心肌組織Bax mRNA、CytC mRNA、Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平升高，給予伊伐布雷定干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種趨勢，而Bcl-2 mRNA水平降低。啟動子區(qū)DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，通過調(diào)控基因的甲基化可調(diào)節(jié)基因表達水平，在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[23]。高等生物中DNA甲基化必須在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下將甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5C上，使其產(chǎn)生5甲基胞嘧啶。本研究結(jié)果顯示，伊伐布雷定對病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡的改善作用可能與調(diào)節(jié)CytC mRNA、Bax mRNA水平有關(guān)，還可能通過降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平，進而提高Bcl-2 mRNA水平，影響線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織凋亡指數(shù)。

綜上所述，伊伐布雷定對CVB3誘導(dǎo)發(fā)生的病毒性心肌炎大鼠心肌組織細胞凋亡具有緩解作用，可降低心肌組織細胞Bax mRNA、CytC mRNA水平，提高Bcl-2 mRNA水平，可能與降低病毒性心肌炎大鼠心肌組織細胞Bcl-2基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平有關(guān)，但具體作用機制需進一步研究。