基于疊氮溴化丙錠結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)分析口腔綜合治療臺(tái)水路系統(tǒng)中活菌多樣性的研究

周如玉，平逸帆，2，張 元，3，王 娟，2*

1南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，3正畸科，江蘇 南京 210029

口腔綜合治療臺(tái)水路系統(tǒng)（dental unit waterline，DUWL）是由相互連接的窄孔塑料管網(wǎng)組成，其輸送的水既作為口腔設(shè)備的冷卻劑，同時(shí)也作為口腔治療期間的沖洗劑［1］。DUWL的特殊結(jié)構(gòu)為微生物的定植和生物膜形成提供了有利條件，已檢測(cè)出細(xì)菌、真菌、病毒及原蟲(chóng)等多種微生物［2-3］?？谇痪C合治療臺(tái)（dental chair unit，DCU）管道水中的微生物可通過(guò)口腔直接進(jìn)入或氣霧吸入等多種方式接觸患者及牙科醫(yī)務(wù)工作者。因此，口腔綜合治療臺(tái)特定的部件及其中的微生物污染是導(dǎo)致交叉感染的可能來(lái)源。嚴(yán)重的微生物污染可能導(dǎo)致醫(yī)務(wù)人員和患者出現(xiàn)健康問(wèn)題，特別是免疫缺陷的患者［4-5］。

2010年，Singh等［6］報(bào)道南非的一名口腔醫(yī)生可能由于職業(yè)因素經(jīng)常暴露在被軍團(tuán)菌污染的氣溶膠中而死于軍團(tuán)菌感染。2012年，Ricci等［7］報(bào)道了一名健康的老年女性患者在接受口腔治療后感染血清Ⅰ型嗜肺軍團(tuán)菌而死亡。研究表明，DUWL 中普遍存在一定的微生物污染［8］。在DUWL出水中檢測(cè)到內(nèi)毒素濃度可達(dá)到1×105EU/mL，DUWL出水形成的氣溶膠中也含有一定濃度的內(nèi)毒素，平均濃度可以達(dá)100 EU/m3；且DUWL中細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素極可能在口腔手術(shù)中刺激組織釋放炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而不利于組織的創(chuàng)口愈合［9］。

高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為微生態(tài)研究中較為先進(jìn)的檢查手段，能更準(zhǔn)確地檢測(cè)出環(huán)境樣品中的細(xì)菌種類(lèi)。但細(xì)菌死亡后數(shù)天乃至數(shù)周內(nèi)其胞內(nèi)DNA 都能夠保持相對(duì)完整，常規(guī)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)無(wú)法區(qū)分所擴(kuò)增的核酸片段的模板DNA來(lái)自于活菌還是死菌，也就無(wú)法排除樣本中死菌和游離DNA的干擾信息［10］。如何使用高通量測(cè)序技術(shù)選擇性地檢測(cè)環(huán)境中的活性細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性是本研究的目的。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是一種新型的核酸結(jié)合染料，能夠穿過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在鹵素光的作用下，PMA與胞內(nèi)的DNA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)，多余的游離PMA可在鹵素光作用下與樣本中的水進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)并失去活性。因此，可以利用PMA對(duì)活、死菌具有選擇的特性，使死菌在DNA純化過(guò)程中被剔除［11］。

本研究將PMA 與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合研究DUWL 活菌微生物群落的構(gòu)成和多樣性，為后期研究提供參考依據(jù)，進(jìn)而更好地評(píng)估DUWL 水質(zhì)污染的情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

封口膜（BEMIS 公司，美國(guó)）；R2A 瓊脂培養(yǎng)基（Oxoid 公司，英國(guó)）；PMA（Biotium，美國(guó)）；細(xì)菌基因組DNA 小量純化試劑盒、rTaq DNA Polymerase（大連寶生物工程有限公司）；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen 公司，美國(guó)）。PMA 溶解于無(wú)菌ddH2O中，配制20 mmol/L PMA溶液-20 ℃避光保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

口腔綜合治療臺(tái)（Sinora公司，德國(guó)）；需氧恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Shellab公司，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈安泰公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Heraeus 公司，德國(guó)）；超微量紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（GE 公司，美國(guó)）；GeneAmp 9700 PCR 儀（ABI 公司，美國(guó)）；QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司，美國(guó)）；Miseq高通量測(cè)序儀（Illumina公司，美國(guó)）。

1.1.3 研究樣本

選擇南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科及牙周病科DCU 33 臺(tái)，其中牙體牙髓病科23 臺(tái)（E組），標(biāo)記為E1～E23；牙周病科10臺(tái)（P組），標(biāo)記為P1～P10。所有納入研究的DCU 均進(jìn)行口腔常規(guī)門(mén)診治療超過(guò)3 個(gè)月，且在取樣前的1 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過(guò)管道維修。除此之外，排除在采樣前3 d 內(nèi)接診過(guò)有艾滋病、肝炎等傳染病史患者的DCU。所有DCU的水路系統(tǒng)均連接過(guò)濾自來(lái)水作為水源水。

1.2 方法

1.2.1 水樣采集

于當(dāng)天上午8 點(diǎn)開(kāi)診前采樣，采樣時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，戴無(wú)菌手套手執(zhí)三用槍槍柄，換上滅菌三用槍頭，空放三用槍水流30 s，用滅菌瓶收集所需水樣量，封口膜封口。采集另一椅位水樣時(shí)更換另一滅菌過(guò)的三用槍頭。所有水樣立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 優(yōu)化PMA前處理濃度

為確定在本研究中使用最佳PMA處理濃度，整個(gè)研究過(guò)程中分析的所有樣本都按照相同的方法制備。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的33臺(tái)DCU水樣結(jié)果，選擇了污染最嚴(yán)重的7臺(tái)DCU和污染最少的6臺(tái)DCU作為研究對(duì)象。采集DUWL 水樣1 800 mL，在微生物實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)中，渦旋震蕩15 s 后將樣本平均分為9等份，每份200 mL。4 ℃6 000 r/min離心3 min，收集菌體沉淀，1 mL 滅菌ddH2O 重懸，收集至1.5 mL滅菌EP管中。

取5份重懸菌體樣本，85 ℃水浴10 min，冰上冷卻10 min，重復(fù)1 次。隨機(jī)抽取其中1 份樣品，在超凈工作臺(tái)中，將熱處理樣本用接種環(huán)均勻涂布于R2A 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用于驗(yàn)證熱滅活細(xì)菌的效果。剩余4份樣本分別標(biāo)記為D1～D4。熱處理樣本（D1～D4）中加入PMA，使PMA的終濃度分別為0、5、10、20 μmol/L。未熱處理的4 份重懸菌體樣本標(biāo)記為L(zhǎng)1～L4，也依次加入PMA，使PMA 的終濃度分別為5、10、20、30 μmol/L。所有8 份樣本都混合均勻，避光靜置處理10 min。樣本置于冰上，使用500 W的鹵素?zé)粼诰喙庠?0 cm處光照5 min，光照交聯(lián)時(shí)不斷翻轉(zhuǎn)樣本，使其充分光照。PMA 處理后的懸浮液于4 ℃12 000 r/min 離心6 min，棄去上清液，使用細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取樣本中的細(xì)菌基因組DNA。

PCR擴(kuò)增目的片段：以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物515F（5′-GTGCAGCMGCCGCGG -3′）及907R（5′ -CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對(duì)16S rRNA 的V4～V5 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；；95 ℃變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s，27 個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃條件下延伸10 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，每管均加2 μL PCR 產(chǎn)物用于1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)觀察瓊脂糖凝膠上的DNA條帶。

1.2.3 33個(gè)樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增制備及高通量測(cè)序

最適PMA濃度預(yù)處理33個(gè)樣本，DNA提取方法同前。并通過(guò)D（260 nm）和D（260 nm）/D（280 nm）評(píng)估提取DNA的濃度和質(zhì)量。PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。在各樣本中的序列拼接一段barcode標(biāo)簽序列，用來(lái)區(qū)分樣本來(lái)源的信息。有效序列是指獲得的原始序列中具有完整的barcode標(biāo)簽序列。本次分析將barcode和前引物（forward primer）序列去除，過(guò)濾read 尾部質(zhì)量值20以下的堿基；拼接序列的overlap區(qū)錯(cuò)配比率不得高于20%；不允許barcode 錯(cuò)配；引物錯(cuò)配數(shù)不得大于2。然后對(duì)有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)優(yōu)化及長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)Usearch 軟件平臺(tái)（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/）在97%的相似水平下對(duì)非重復(fù)序列（剔除單序列）進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)；使用R 軟件繪制稀釋曲線及Alpha 多樣性指數(shù)，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMA最適濃度篩選結(jié)果

接種于R2A瓊脂培養(yǎng)基的熱處理樣本，37 ℃培養(yǎng)6 d，未見(jiàn)菌落形成，證明熱處理能有效殺死樣本中的活菌。由圖1A 可知，對(duì)于熱處理組水樣，隨著PMA 濃度的增加，條帶逐漸變暗，PMA 終濃度為20 μmol/L時(shí)，條帶完全消失。說(shuō)明PMA能夠與樣本中死菌DNA 發(fā)生反應(yīng)并抑制其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，終濃度20 μmol/L的PMA能夠有效阻止所有死菌DNA的PCR擴(kuò)增。由圖1B可知，對(duì)于未進(jìn)行熱處理的常規(guī)水樣，隨著PMA 濃度的增加，條帶未見(jiàn)明顯變暗或消失。說(shuō)明對(duì)于常規(guī)水樣，即使增加PMA 濃度至30 μmol/L 也不會(huì)影響正?；罹腜CR 擴(kuò)增。由此確定PMA 處理DUWL 水樣的最適濃度為20 μmol/L。在這一濃度作用下，PMA 不影響活菌DNA 的PCR擴(kuò)增，同時(shí)保證能抑制樣本中死菌DNA的PCR擴(kuò)增。

圖1 PMA-PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Results of PMA-PCR amplification

2.2 Miseq測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 樣本測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)

33 個(gè)樣本中共獲得序列數(shù)1 216 470 條，檢測(cè)序列的質(zhì)量及嵌合體，并比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到978 054條高質(zhì)量序列。剔除barcode標(biāo)簽序列和前引物序列獲得的序列平均長(zhǎng)度為396 bp。

稀釋曲線表明在5 000 條序列前，OTU 數(shù)量隨序列數(shù)增加大幅增加；在5 000～15 000 條序列時(shí)，OTU數(shù)量的增加趨于平緩；25 000條序列后，各組的OTU 數(shù)量進(jìn)入平臺(tái)期，OTU 量基本達(dá)到飽和（圖2A）。香農(nóng)-威納（Shannon-Wiener）曲線則顯示隨著測(cè)序量的增加，香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index）不斷增大；當(dāng)測(cè)序值達(dá)到5 000 以上后，各組曲線均進(jìn)入了平臺(tái)期（圖2B）。

圖2 樣本測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)Figure 2 Sample sequencing results and diversity index

33 組的平均測(cè)序覆蓋深度（Coverage 指數(shù)）均大于99.67%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，且間接反映了物種的豐富度，即樣本的當(dāng)前測(cè)序深度足夠反映該群落樣本所包含的微生物多樣性，可以進(jìn)入下一步分析。

OTU水平、Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、豐富度指數(shù)等多樣性統(tǒng)計(jì)指數(shù)提示DUWL 中存在豐富的細(xì)菌群落構(gòu)成和多樣性（圖3）。E 組物種豐度指數(shù)（Chao、Ace 值）顯著高于P 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；物種多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）顯示兩組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 兩組Alpha多樣性分析Figure 3 Alpha diversity analysis of the two groups

2.2.2 微生物群落組成分析

微生物門(mén)分類(lèi)分析：從門(mén)的分布水平看（圖4），在所有序列中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）（56.71%）是相對(duì)豐度占比最高的門(mén)類(lèi)，其次是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）（16.89%）、異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）（10.36%）、藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）（3.10%）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）（2.78%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）（2.11%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）（1.45%）、衣原體門(mén)（Chlamydiae）（1.20%）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）（1.13%）。以上菌門(mén)在33 個(gè)樣本中檢出率為100%

圖4 E組和P組33個(gè)樣本菌群在在門(mén)水平上的分類(lèi)Figure 4 Dominant bacterial communities at the phylum level of 33 samples from E group and P group

微生物屬分類(lèi)分析：從屬的分布水平看（圖5），相對(duì)豐度較高的菌屬有棲熱菌屬（Thermus）（10.32%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）（10.19%）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）（7.04%）、軍團(tuán)菌屬（Legionella）（6.09%）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）（5.95%）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）（4.62%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（4.35%）、Reyranella（2.94%）、Obscuribacterales_norank（2.56%）、腸球菌屬（Enterococcus）（2.34%）、Methyloversatilis（1.73%）、全孢菌屬-未培養(yǎng)（Holosporaceae_uncultured）（1.44%）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）（1.33%）、浮霉?fàn)罹?未培養(yǎng)（Planctomycetaceae_uncultured）（1.30%）、水桿菌屬（Aquabacterium）（1.12%）、亞硝化單胞菌科-未培養(yǎng)Nitrosomonadaceae_uncultured（1.05%）、鞘脂菌屬Sphingobium（1.01%）。以上菌屬在33個(gè)樣本中檢出率為100%。33個(gè)樣本檢測(cè)出了4種條件致病菌屬：軍團(tuán)菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）（0.44%），檢出率為100%。E 組共檢測(cè)出81個(gè)菌屬，有8.73%（59 514/681 674）的序列不能被歸為任何菌屬；P 組共檢測(cè)出54 個(gè)菌屬，有11.05%（32 739/296 380）的序列不能被歸為任何菌屬，故只能在更高一級(jí)的分類(lèi)水平中進(jìn)行分析。

圖5 E組和P組33個(gè)樣本菌群在屬水平上的分類(lèi)Figure 5 Dominant bacterial communities at the genus level of the 33 samples from E group and P group

組間門(mén)、屬分類(lèi)差異性分析：基于群落豐度數(shù)據(jù)對(duì)E 組和P 組群落門(mén)、屬分類(lèi)水平顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)，運(yùn)用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)方法分析可以檢測(cè)到組間微生物群落中豐富度具有差異性的物種。由圖6可見(jiàn)E組與P組樣本中檢出的菌門(mén)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的為藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、衣原體門(mén)（Chlamydiae、Aerophobetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、Bacteria_d_norank_k_unclassified、TM6；屬水平上，軍團(tuán)菌屬（Legionella）、Methyloversatilis、Obscuribactera-les_o_norank差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

物種主坐標(biāo)分析：基于unweighted Unifrac 距離進(jìn)行物種主坐標(biāo)分析，PCoA圖是根據(jù)方差分解將每個(gè)樣本群落之間的差異通過(guò)二維坐標(biāo)圖反映出來(lái)，坐標(biāo)圖中的1 個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)樣本信息，兩個(gè)點(diǎn)之間的距離越近，表明兩者之間的組成差異越小。第1主成分對(duì)樣品差異的解釋率為26.73%，第2主成分對(duì)樣品差異的解釋率為7.59%。從圖7可知E 組樣本（18/23）聚集在一起，P組樣本（9/10）聚集在一起，并且這兩組樣本在PCoA 的橫軸上被區(qū)分，形成了兩個(gè)單獨(dú)的集群。這表明兩組樣本組內(nèi)群落間的相似性較高，而這兩組樣本組間的群落組成存在輕微差異性。

圖7 各樣本微生物群落差異性PCoA分析Figure 7 PCoA analysis of the differences of microbial community among samples

3 討論

通過(guò)PMA預(yù)處理方法與Miseq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了33臺(tái)DUWL水樣中活菌群落構(gòu)成和多樣性，研究結(jié)果表明，DUWL 中微生物群落多樣性的信息要比以往研究結(jié)果豐富，且檢出的細(xì)菌種屬類(lèi)別也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往的檢測(cè)方法［12］。33臺(tái)DUWL樣本中共得到978 054條優(yōu)質(zhì)序列，兩組共有的OTU為753個(gè)，檢測(cè)的共有優(yōu)勢(shì)菌門(mén)及共有較高豐度的菌屬是DUWL 中的共有核心微生物，其中一些細(xì)菌屬序列僅存在E 組或P 組。Miseq 測(cè)序結(jié)果中未被分類(lèi)或是尚未被培養(yǎng)出的菌屬約占檢出菌屬的50%，這些都是以往研究中未能培養(yǎng)出的或者未知的種屬。在本研究中，所有樣本均檢測(cè)出了4種條件致病菌屬：軍團(tuán)菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬，檢出率為100%。G?ksay等［13］曾對(duì)土耳其伊斯坦布爾市的59個(gè)DUWL水樣進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，僅在其中的14個(gè)樣品中檢測(cè)出了假單胞菌，檢出率為24%。我們前期也對(duì)條件致病菌進(jìn)行培養(yǎng)研究，采用CFC假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基對(duì)科室25 個(gè)DUWL 水樣進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，在不同濃度條件下均未檢出假單胞菌，在成功完成高通量測(cè)序的16 個(gè)樣本中均檢測(cè)到了假單胞菌屬的存在，豐度0.52%～8.32%不等［14］。

軍團(tuán)菌屬和假單胞菌屬這兩種常見(jiàn)的條件致病菌在每個(gè)樣本中均可被檢出，且軍團(tuán)菌屬的檢出豐度高于假單胞菌屬。由此可推測(cè)軍團(tuán)菌屬和假單胞菌屬在DUWL中普遍存在。德國(guó)飲用水條例和醫(yī)院衛(wèi)生感染預(yù)防委員會(huì)要求所有DUWL中的軍團(tuán)菌濃度＜100 CFU/100 mL，總菌落計(jì)數(shù)＜100 CFU/mL。尤其當(dāng)免疫受損的患者接受治療時(shí)，DUWL 的輸出水中不能檢測(cè)出銅綠假單胞菌、隱孢子蟲(chóng)和軍團(tuán)菌。為保持DUWL水質(zhì)，建議DUWL供水只能使用飲用水或無(wú)菌水［4］。文獻(xiàn)報(bào)道導(dǎo)致健康人發(fā)生感染的銅綠假單胞菌濃度需大于1.5×106CFU/mL［15］，而Jensen等［16］提出頻繁的牙科治療才可能導(dǎo)致感染風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。本研究中軍團(tuán)菌屬、假單胞菌屬占總體群落的相對(duì)豐度并不高，含量遠(yuǎn)小于致病量，DUWL中的軍團(tuán)菌屬和假單胞菌屬可能大多數(shù)處于活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)。因此，健康人群在接觸DUWL 水后受到軍團(tuán)菌屬及假單胞菌屬感染的可能性極低，且臨床上尚未有大規(guī)模的醫(yī)源性感染暴發(fā)。

2015年，Costa等［17］采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)法國(guó)普瓦捷市7個(gè)DUWL水樣的細(xì)菌多樣性及確定其潛在的細(xì)菌致病序列，該研究共檢出394 個(gè)屬水平序列。其中條件致病菌屬中軍團(tuán)菌屬的豐度與本研究的豐度較為相似，假單胞菌屬略高于本研究的豐度。但在細(xì)菌群落構(gòu)成上與本研究存在較大差異，多樣性和豐富性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果。導(dǎo)致研究差異的原因可能為：①DUWL 中出水的水質(zhì)受到供水水源、椅位使用率、接診患者數(shù)量和類(lèi)型的影響。中國(guó)和法國(guó)市政供水的水質(zhì)不同。且與法國(guó)相比，中國(guó)的椅位使用率更高，每日接診患者量更多，接診患者口腔衛(wèi)生狀況有差異，這些都可能是導(dǎo)致研究結(jié)果中群落構(gòu)成差異的原因。②Costa的研究中檢出的多樣性和豐富性不能排除死菌和游離DNA的信息，而本研究用PMA進(jìn)行預(yù)處理，僅對(duì)活菌的群落構(gòu)成進(jìn)行檢測(cè)，因而導(dǎo)致樣本多樣性較低。

PCoA 結(jié)果表明E 組和P 組間微生物群落構(gòu)成的相似性較低，而各組組內(nèi)微生物群落之間的相似性較高。兩個(gè)科室雖然都是通過(guò)市政供水，但考慮到牙體牙髓病科室可能使用高速及低速手機(jī)的頻率較牙周病科室高，DCU回吸患者口腔中液體的概率較大［18］，可能導(dǎo)致其DUWL 管道內(nèi)微生物種類(lèi)較牙周病科多。且兩個(gè)科室診治的疾病不同，牙體牙髓病科主要是針對(duì)齲病、牙髓病及根尖周病的治療，主要致病菌為變形鏈球菌、放線菌、乳酸桿菌等；牙周病科主要治療牙齦炎、牙周炎等，主要致病菌為伴放線放線桿菌、福賽坦氏菌、牙齦卟啉單胞菌這些厭氧菌和兼性厭氧菌。

此外，在33臺(tái)DUWL中均發(fā)現(xiàn)了與飲用水中相同的細(xì)菌菌門(mén)，可能與本研究中DUWL 的供水來(lái)自市政供水系統(tǒng)有關(guān)［19］。以往研究也表明變形菌門(mén)是DUWL 中最普遍的細(xì)菌菌門(mén)，大約占總序列的60%以上，與本研究結(jié)果相似［2］。變形菌門(mén)通常在飲用水系統(tǒng)中檢測(cè)到，相對(duì)豐度最高，可能是因?yàn)榕c其他菌門(mén)相比對(duì)氯具有更好的耐受性。因此，本研究認(rèn)為水源水質(zhì)狀況可能是導(dǎo)致不同地區(qū)DUWL細(xì)菌群落差異的原因之一，這種差異性還可能與科室間及椅位間的使用情況、牙科設(shè)備或水路系統(tǒng)中管道的安裝及水路系統(tǒng)中存在多樣化的環(huán)境等因素有關(guān)。

DUWL管道狹長(zhǎng)，內(nèi)壁粗糙，近管壁處的水流流速緩慢，且大部分時(shí)間管道內(nèi)水流都處于停滯狀態(tài)，水中的微生物易于沉積附著于管壁，這是DUWL污染嚴(yán)重的一個(gè)重要原因［3］。嚴(yán)重污染的管道水中基線水平細(xì)菌總數(shù)（total viable counts，TVC）可為1×104～1×106CFU/mL，本課題組前期實(shí)驗(yàn)測(cè)得南京地區(qū)自來(lái)水中TVC 為（33.33±22.31）CFU/mL。為控制DUWL 污染現(xiàn)狀，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，提出多種改善DUWL 供水質(zhì)量、減少交叉感染的措施。課題組前期實(shí)驗(yàn)中使用臭氧水消毒機(jī)，采用低壓電解原理，通過(guò)導(dǎo)電納米金剛石瞬間將水電解為高濃度臭氧水，工作時(shí)不受環(huán)境和溫度的影響，產(chǎn)物不含氮氧化物，無(wú)致癌物質(zhì)，為目前制備醫(yī)用臭氧水領(lǐng)域最快速、便捷、安全的新技術(shù)［20］。前期實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察DUWL 經(jīng)臭氧水溶液處理后的水質(zhì)是否和國(guó)際要求相符，本研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步探究臭氧水溶液對(duì)于DUWL 中具體致病菌及未獲培微生物的影響提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果有助于更好地了解DUWL 中微生物群落活菌構(gòu)成及與牙科治療相關(guān)的潛在傳染性風(fēng)險(xiǎn)，且更好地管理DUWL水質(zhì)。綜上所述，DUWL微生物致病菌的檢測(cè)對(duì)醫(yī)院感染安全監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。建立一種可靠的微生物群落活菌檢測(cè)方法不僅能較準(zhǔn)確地提供DUWL 中微生物群落的信息，同時(shí)也可以為疾病預(yù)防、治療和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。對(duì)制定適應(yīng)我國(guó)國(guó)情的口腔科用水標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)估消毒方法的有效性、減少院內(nèi)感染和預(yù)防相關(guān)疾病也有著重要的指導(dǎo)意義。雖然因檢測(cè)費(fèi)用昂貴，研究的樣本數(shù)量有限，但本研究結(jié)果仍表明，應(yīng)定期監(jiān)測(cè)DUWL水質(zhì)，并采取預(yù)防措施以防微生物污染。