金納米顆粒-微氣泡復(fù)合材料及其體外成像和光熱性能研究

岳遠(yuǎn)斌，趙 嬋，劉 昊，紀(jì)曉然，段 磊

南京醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，江蘇 南京 211166

金納米顆粒（gold nanoparticl，AuNP）作為一種等離激元納米顆粒，具有良好的光熱轉(zhuǎn)換特性，可以高效吸收特定波長的光，通過表面等離激元共振作用實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換，是一種優(yōu)異的光熱治療劑［1］，同時(shí)AuNP 本身易于修飾且具有高穩(wěn)定性，在生物相容性和細(xì)胞毒性等方面也表現(xiàn)出優(yōu)異的性質(zhì)，可與各種類型的生物分子或靶體結(jié)合實(shí)現(xiàn)功能化［2］。微氣泡作為常見的超聲造影劑，具有可修飾的膜殼材料和氣體內(nèi)核，不僅能有效提高超聲圖像的對比度，而且易于裝載其他造影劑成分、藥物及納米材料［3］，基于微氣泡診療一體化平臺的研究近年來受到了廣泛關(guān)注［4-7］。

目前已有研究表明，AuNP 與微氣泡結(jié)合形成的金納米顆粒-微氣泡復(fù)合結(jié)構(gòu)能使微氣泡的非線性響應(yīng)得到增強(qiáng)，影響其超聲造影能力［8-9］。此外，AuNP 與微氣泡結(jié)合后，在一定強(qiáng)度連續(xù)近紅外光的照射下，AuNP 產(chǎn)生的熱量不僅可以用于光熱治療［10］，還會傳導(dǎo)至微氣泡的氣芯，一方面引起周期性氣體熱膨脹現(xiàn)象，從而產(chǎn)生高強(qiáng)度的光聲信號［11］，另一方面當(dāng)微氣泡內(nèi)核氣體遇熱迅速膨脹導(dǎo)致氣泡破裂時(shí)，可損壞周圍的癌細(xì)胞和組織，達(dá)到更好的治療效果［12］。因此，金納米顆粒-微氣泡復(fù)合材料是一種具有潛力的、集光聲/超聲雙模態(tài)造影、腫瘤治療于一體的多功能造影劑。然而，基于金納米材料和微氣泡的診療一體化復(fù)合材料的研究仍不夠深入和系統(tǒng)，AuNP 與微氣泡的不同結(jié)合方式對超聲成像效果的影響、對光熱效應(yīng)的影響及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。

本研究的目標(biāo)是制備出空白微氣泡（microbubble，MB），并將AuNP 和微氣泡通過不同的方式結(jié)合，構(gòu)建兩種結(jié)構(gòu)的金納米顆粒-微氣泡復(fù)合材料，即包金微氣泡（gold encapsulated microbubble，AuMB）和載金微氣泡（polyethyleneimine-gold loaded microbubble，PEI-AuMB），對兩類復(fù)合材料進(jìn)行理化性質(zhì)的評估，并在體外探討結(jié)構(gòu)改變對其超聲造影能力和光熱轉(zhuǎn)換效率的影響，分析其影響機(jī)制?？瞻孜馀菖c兩種金納米顆粒-微氣泡的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 空白微氣泡、包金微氣泡和載金微氣泡的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic illustration of the structure of MB,AuMB and PEI-AuMB

1 材料和方法

1.1 材料

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）［重均分子量（MW）=31 000］和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide，NHS）（上海阿拉丁控股集團(tuán)有限公司）；左旋聚乳酸［poly（L-lactic acid），PLLA］［重均分子量（MW）=30 000，山東岱崗生物科技有限公司］；二氯甲烷（CH2Cl2）（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；AuNP 和聚乙烯亞胺-金納米顆粒（polyethyleneimine-gold nanoparticle，PEI-AuNP）（南京東納生物科技有限公司）；1-乙基-（3-2甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸性鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl］（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；2-（N-嗎啉）-乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate，MES）（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 MB和AuMB的制備

首先將0.15 g 的PLLA 溶解到10 mL 的二氯甲烷中，向二氯甲烷溶液中加入2 mL 超純水，使用超聲波細(xì)胞破碎儀（南京先歐儀器制造有限公司）將得到的溶液乳化1 min，功率為100 W；然后將得到的乳液加入5%的PVA 水溶液中，使用數(shù)控頂置式電子攪拌器（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）攪拌4 h，得到微囊溶液；接著將得到的微囊溶液3 000 r/min 離心分離，并多次洗滌至上清液透明清澈，收集樣品沉淀；最后將洗凈后的樣品加入西林瓶中冷凍干燥，同時(shí)向西林瓶中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甘露醇作為冷凍保護(hù)劑，冷凍干燥完成后向西林瓶中緩慢沖入氮?dú)?，得到MB。

AuMB的制備方式和MB相似，只需要將第一步中的超純水換成金納米顆粒的水溶液。

1.2.2 PEI-AuMB的制備

首先將制備中使用的PVA 水溶液按照段磊等［13］的方法進(jìn)行羧基化，按照制備MB 的步驟制備出羧基化空白微囊。之后將離心洗滌后的微囊懸浮在MES 緩沖液（50 mmol/L，pH=5.4）中，向懸浮液中加入EDC·HCL（0.4 mg/mL）和NHS（0.6 mg/mL）激活微囊表面羧基，接著向激活后的懸浮液中加入PEI-AuNP，室溫下孵育24 h后洗凈樣品并收集樣品沉淀。最后將洗凈后的樣品加入西林瓶中冷凍干燥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的甘露醇作為冷凍保護(hù)劑，冷凍干燥完成后向瓶中緩慢沖入氮?dú)?，得到PEIAuMB。

1.2.3 材料的特性表征

使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（JEOL 公司，日本）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（JEOL 公司，日本）觀察MB、AuMB 和PEI-AuMB 的結(jié)構(gòu)和形貌。使用粒度儀（Anton Paar 公司，奧地利）測定MB、AuMB、PEI-AuMB 和金納米顆粒的粒徑分布和Zeta 電位。使用酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 公司，美國）測定MB、AuMB、PEI-AuMB 和AuNP 的紫外-可見光消光光譜。使用熱分析儀（PerkinElmer 公司，美國）測定MB、AuMB 和PEI-AuMB 的差示掃描量熱分析曲線。

1.2.4 體外超聲成像實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室制備了與人體軟組織聲阻抗相似的體模，體模中有一個(gè)用于注入樣品的孔洞，將樣品注入體模后，通過小動物超聲系統(tǒng)（Visual Sonics 公司，加拿大）進(jìn)行成像，超聲探頭頻率為18MHz。

實(shí)驗(yàn)中AuMB、PEI-AuMB 和MB 的濃度均為1×108個(gè)/mL，AuMB-1、AuMB-2、AuMB-3 的載金濃度分別為5.5×10-3、7.5×10-3、2.1×10-2mg/mL，PEIAuMB-1、PEI-AuMB-2、PEI-AuMB-3的載金濃度分別為1.6×10-2、3.4×10-2、4.8×10-2mg/mL。所有實(shí)驗(yàn)都在相同條件下進(jìn)行，即相同的溫度、溶劑和超聲成像參數(shù)。

1.2.5 體外光熱轉(zhuǎn)換能力實(shí)驗(yàn)

將0.2 mL 不同載金濃度的AuMB 和PEI-AuMB加入到96 孔板中，使用波長為520 nm 的激光照射15 min，其中激光器的功率分別選用0.5、1.0、1.5、2.0 W，在激光照射過程中，使用熱成像儀（FLIR 公司，美國）實(shí)時(shí)記錄溶液的溫度，并設(shè)定MB和AuNP作為對照組。

本實(shí)驗(yàn)中AuMB、PEI-AuMB和MB的濃度均為1×108個(gè)/mL，AuMB的載金濃度分別為5.5×10-3、7.5×10-3、2.1×10-2mg/mL，PEI-AuMB 的載金濃度分別為1.6×10-2、3.4×10-2、4.8×10-2mg/mL，AuNP 濃度為4.0×10-2mg/mL。激光照射距離均為5 cm，光斑直徑為5 mm。

2 結(jié)果

2.1 材料特性表征

15 nm 的AuNP 包裹于微氣泡氣體內(nèi)核中制備包AuMB，另外選用了15 nm的PEI-AuNP，通過PEIAuNP 表面的氨基與微氣泡表面的羧基偶聯(lián)制備了載PEI-AuMB，AuNP 和PEI-AuNP 的光吸收特性及其納米顆粒內(nèi)核尺寸大小沒有區(qū)別（圖2）。對AuMB、PEI-AuMB 和MB 進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡表征（圖3）：MB表面光滑，內(nèi)部有清晰的膜殼結(jié)構(gòu)；AuMB內(nèi)核中可見尺度為15 nm的納米顆粒，證實(shí)了AuNP在微氣泡內(nèi)核的成功裝載，此外，其表面偶見少許納米顆粒，這是因?yàn)橹苽溥^程中，少量未被包覆到微氣泡內(nèi)部的AuNP吸附到了微氣泡表面；PEI-AuMB的表面可見顆粒狀物質(zhì)，透射電鏡結(jié)果也證實(shí)大量納米顆粒分布于其膜殼表面，即是通過共價(jià)鍵偶聯(lián)于微氣泡表面。

圖2 AuNP和PEI-AuNP的透射電鏡圖片及紫外-可見光消光光譜Figure 2 TEM images and optical extinction spectroscopy of AuNP and PEI-AuNP

圖3 MB、AuMB和PEI-AuMB的掃描電鏡和透射電鏡圖片F(xiàn)igure 3 SEM and TEM images of MB，AuMB and PEI-AuMB

為研究AuNP的裝載對微氣泡粒徑和穩(wěn)定性的影響，對AuNP、PEI-AuNP、MB、AuMB 和PEI-AuMB的粒徑分布和Zeta 電位進(jìn)行了檢測（圖4）。AuNP的平均水動力尺寸為（84.18±34.07）nm，Zeta電位為（-23.73±1.48）mV，聚乙烯亞胺修飾后的PEI-AuNP的平均水動力尺寸為（133.36±3.62）nm，Zeta電位改變?yōu)椋?9.50±1.67）mV，MB 的平均粒徑為（0.59±0.26）μm，Zeta 電位為（-27.38±0.46）mV；AuMB 和PEI-AuMB 的平均粒徑分別為（0.63±0.38）μm 和（0.71±0.53）μm，與MB相比有些許增加，說明AuNP在MB內(nèi)部及表面的裝載對微氣泡的粒徑有一定影響。AuMB與MB的Zeta電位基本相同，在-27mV附近，說明將AuNP包裹到MB內(nèi)部不會對其表面Zeta電位造成影響，保持了體系的穩(wěn)定性。而PEIAuMB的Zeta電位為（38.06±0.89）mV，與MB相比有明顯變化，說明Zeta電位為正值的PEI-AuNP被裝載到MB表面后，會對微氣泡電位帶來顯著影響，也進(jìn)一步印證了PEI-AuNP 在MB 表面成功裝載，此外，PEI-AuMB 的Zeta 電位絕對值升高也顯示了此體系穩(wěn)定性提高。

圖4 MB、AuMB、PEI-AuMB、AuNP和PEI-AuNP的粒徑分布和Zeta電位分布Figure 4 Particle size distribution and Zeta potential distribution of MB，AuMB，PEI-AuMB，AuNP and PEI-AuNP

通過紫外-可見光消光光譜評估了AuNP-微氣泡復(fù)合材料的光吸收特性。圖5A 是AuMB、PEIAuMB、MB 和AuNP 的紫外-可見光消光光譜圖。AuNP 的吸收峰在520 nm 附近，PEI-AuMB 在520 nm 附近也對應(yīng)出現(xiàn)了1 個(gè)明顯的吸收峰。這一方面印證了AuNP 在微氣泡上的成功裝載，另一方面也說明AuNP在微氣泡表面的裝載沒有改變其光吸收特性；此外，AuMB 在400～600 nm 范圍內(nèi)未有明顯的吸收峰出現(xiàn)，說明當(dāng)AuNP 被包裹在微氣泡內(nèi)部時(shí)，受自身團(tuán)聚方式及微氣泡聚合物膜殼材料的影響，光吸收特性有所改變。對AuMB、PEI-AuMB和AuNP 懸浮液的觀察印證了以上光譜結(jié)果，PEIAuMB 與AuNP 顏色相近，均為淺玫紅色，而AuMB呈淺紫色（圖5B），這與PEI-AuMB 和AuNP 的吸收峰更為接近的結(jié)果相一致。

圖5 不同微氣泡的紫外-可見光消光光譜及其在自然光下的顏色Figure 5 Optical extinction spectroscopy and color of suspension solution of AuMB，PEI-AuMB，MB and AuNP

為研究AuNP 的裝載對微氣泡膜殼性質(zhì)的影響，對MB、AuMB和PEI-AuMB進(jìn)行了差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析（圖6）。可以看到相較于MB 的單峰，AuMB 和PEIAuMB 的DSC 曲線均出現(xiàn)了熔融雙峰。對于AuMB來說，大部分AuNP 在制備過程中被包裹于其膜殼內(nèi)核，相互聚集并通過分子間作用力吸附在微氣泡膜殼內(nèi)表面，少部分未被包裹的AuNP 吸附到微氣泡膜殼外表面，DSC檢測時(shí)，隨著溫度的升高，在微氣泡膜殼材料熔融之前，納米粒子與膜殼之間的吸附力先被破壞，產(chǎn)生了微小的吸熱峰；而對PEI-AuMB來說，隨著溫度升高，由PEI-AuMB膜殼表面羧基與PEI-AuNP表面氨基構(gòu)成的共價(jià)鍵被破壞，共價(jià)鍵斷裂產(chǎn)生了吸熱峰，也使得PEI-AuMB的DSC曲線出現(xiàn)了兩個(gè)熔融峰。DSC分析結(jié)果表明AuMB和PEI-AuMB的膜殼性質(zhì)與MB的膜殼性質(zhì)存在差異。

圖6 MB、AuMB和PEI-AuMB的差示掃描量熱分析Figure 6 Differential scanning calorimetry curve of MB，AuMB and PEI-AuMB

2.2 體外超聲成像

為了研究AuNP-微氣泡復(fù)合材料的超聲造影能力，選用了MB以及不同載金濃度的AuMB-1、AuMB-2、AuMB-3 和PEI-AuMB-1、PEI-AuMB-2、PEIAuMB-3，并通過自制的體模進(jìn)行超聲成像（圖7A～D）。各濃度的AuMB 和PEI-AuMB 相比于MB都有更強(qiáng)的超聲信號，并且當(dāng)裝載的AuNP 濃度升高時(shí)，超聲信號強(qiáng)度也隨之提高，說明AuNP的裝載改變了微氣泡的超聲造影性能。此外，我們還進(jìn)一步比較了AuMB 和PEI-AuMB 的超聲造影能力。，相比于PEI-AuMB，AuMB在造影初期表現(xiàn)出了更強(qiáng)的圖像增強(qiáng)能力，而隨著時(shí)間的延長，PEI-AuMB 表現(xiàn)出更好的持續(xù)顯影能力（圖7E）。

圖7 MB、AuMB和PEI-AuMB的超聲成像圖片F(xiàn)igure 7 Ultrasound images of MB,AuMB and PEI-AuMB

2.3 體外光熱轉(zhuǎn)換能力

對AuMB 和PEI-AuMB 的體外光熱轉(zhuǎn)換能力進(jìn)行了研究，以評估它們用于光熱治療的潛力。圖8A 和圖9A 是MB、AuNP、AuMB 和PEI-AuMB 在激光照射下的光熱升溫曲線?？梢园l(fā)現(xiàn)隨著激光照射時(shí)間的增加，3 種載金濃度的AuMB 和PEIAuMB 溫度均得到提高，且相比于單獨(dú)的AuNP，AuMB 和PEI-AuMB 有著更強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力。同時(shí)，我們還研究了微氣泡載金濃度與光熱轉(zhuǎn)換能力的關(guān)系（圖8C，圖9C），可以發(fā)現(xiàn)，在相同功率激光的介導(dǎo)下，AuMB和PEI-AuMB在15 min內(nèi)的最高溫度與載金濃度呈正相關(guān)。圖8B、D 和圖9B、D 研究了AuMB（載金濃度為5.5×10-3mg/mL）與PEI-AuMB（載金濃度為3.4×10-2mg/mL）的光熱轉(zhuǎn)換能力與激光功率的關(guān)系。結(jié)果表明，AuMB 和PEI-AuMB 的光熱轉(zhuǎn)換能力隨激光功率的提高而增強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)。圖8E 和圖9E 研究了AuMB（載金濃度為5.5×10-3mg/mL）與PEI-AuMB（載金濃度為3.4×10-2mg/mL）在激光照射下的光熱穩(wěn)定性，可以發(fā)現(xiàn)在每個(gè)激光照射周期內(nèi)，AuMB和PEI-AuMB的光熱轉(zhuǎn)換能力幾乎沒有改變，這表明AuMB和PEI-AuMB具有良好的光熱穩(wěn)定性。

圖8 MB、AuNP和AuMB在激光照射下的溫度變化曲線和光熱轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性曲線Figure 8 Temperature variation curve of MB，AuNP and AuMB under laser irradiation，photothermal conversion stability of AuMBs under laser irradiation

圖9 MB、AuNP和PEI-AuMB在激光照射下的溫度變化曲線和光熱轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性曲線Figure 9 Temperature variation curve of MB，AuNP and PEI-AuMB under laser irradiation，photothermal conversion stability of PEI-AuMBs under laser irradiation

此外，我們還對比了AuMB（載金濃度為5.5×10-3mg/mL）與PEI-AuMB（載金濃度為1.6×10-2mg/mL）的光熱轉(zhuǎn)換能力（圖10）。結(jié)果表明，載金濃度較低的AuMB 反而比載金濃度高的PEI-AuMB 表現(xiàn)出了更強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力。

圖10 MB、AuMB和PEI-AuMB在激光照射下的光熱升溫曲線Figure 10 Temperature variation curve of MB,AuMB and PEI-AuMB under laser irradiation

3 討論

本研究將AuNP裝載到了微氣泡的表面及氣體內(nèi)核中，構(gòu)建了兩種結(jié)構(gòu)的AuNP-微氣泡復(fù)合材料，并對其超聲造影和光熱轉(zhuǎn)換能力進(jìn)行了評估和比較。

微氣泡的超聲造影能力與其膜殼的力學(xué)性質(zhì)相關(guān)，而影響力學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵因素是膜殼結(jié)構(gòu)［14-16］。結(jié)合DSC分析的結(jié)果，AuMB和PEI-AuMB超聲造影能力增強(qiáng)的原因主要有以下兩個(gè)方面：一方面，AuNP的裝載使得微氣泡膜殼的厚度和組成改變，從而影響了微氣泡的力學(xué)特性，改善了超聲造影的能力；另一方面，當(dāng)微氣泡破損后，殘存的AuNP聚集在一起，也可能對超聲造影有增益效果［17］。此外，載金濃度更高的微氣泡表現(xiàn)出了更強(qiáng)的造影能力，這說明在一定裝載范圍內(nèi)，更高濃度的AuNP 在微氣泡表面或氣體內(nèi)核中的不均勻堆積會產(chǎn)生復(fù)雜的線性和非線性信號［18］，使得具有更高AuNP 裝載量的微氣泡能夠表現(xiàn)出更好的圖像亮度。通過對比AuMB和PEI-AuMB的超聲造影能力發(fā)現(xiàn)，AuMB在造影初期表現(xiàn)出了更強(qiáng)的圖像增強(qiáng)能力，這是因?yàn)樵谥苽溥^程中，AuNP 在AuMB 的氣芯內(nèi)團(tuán)聚，導(dǎo)致AuMB 的收縮被抑制，降低了AuMB氣體的擴(kuò)散速率，增強(qiáng)了超聲造影的效果［19］，但AuNP在AuMB內(nèi)的團(tuán)聚也會導(dǎo)致AuMB剛性增強(qiáng)，在超聲波的作用下迅速破裂，導(dǎo)致在整個(gè)超聲造影過程中信號的迅速衰弱；而隨著時(shí)間的延長，PEI-AuMB 表現(xiàn)出更好的持續(xù)顯影能力，這是因?yàn)橥獠垦b載的AuNP 僅有一部分與微氣泡的表面膜殼相連，其他部分暴露在介質(zhì)中，具有較高的自由度，在超聲波的作用下，微氣泡振動的不對稱性得到增強(qiáng)，從而提高了超聲造影的效果和持續(xù)時(shí)間［20］。

除MB、AuMB 和PEI-AuMB 的超聲造影能力不同外，本研究結(jié)果還表明，AuMB 和PEI-AuMB 相比于單獨(dú)的AuNP 具有更好的光熱轉(zhuǎn)換能力，主要原因有以下兩點(diǎn)：①相比于自由分散在溶液中的AuNP，AuMB和PEI-AuMB中的AuNP有更高的穩(wěn)定性和聚集濃度［21-22］，提高了光熱轉(zhuǎn)換效率；②AuNP溫度升高后會與微氣泡氣體內(nèi)核發(fā)生作用，引起微氣泡振蕩［23］，提高了產(chǎn)熱能力。此外，AuMB表現(xiàn)出了比PEI-AuMB 更好的光熱轉(zhuǎn)換能力，這是因?yàn)楫?dāng)AuNP 包裹于微氣泡氣體內(nèi)核中時(shí)發(fā)生團(tuán)聚，使AuNP 的光熱轉(zhuǎn)換能力增強(qiáng)［24］，且體系散熱能力較弱；而當(dāng)AuNP 偶聯(lián)在微氣泡膜殼表面時(shí)，PEIAuMB上的AuNP僅是堆積排列在微氣泡膜殼表面，從AuMB 與PEI-AuMB 的懸浮液顏色也可以發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)。

綜上所述，本研究證明了AuNP 的裝載可改變微氣泡的聲學(xué)性質(zhì)，更有利于增強(qiáng)超聲成像，同時(shí)，在激光照射下，裝載AuNP的微氣泡比單獨(dú)的AuNP具有更強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力。由于兩種微氣泡結(jié)構(gòu)的差異，在性能上它們也各有特點(diǎn)，AuMB具有更好的光熱轉(zhuǎn)換能力；PEI-AuMB 有更穩(wěn)定的持續(xù)超聲造影增強(qiáng)能力。因此，AuNP-微氣泡復(fù)合材料是良好的超聲造影劑和潛在的光熱治療劑。此外，金納米材料的形狀會影響其光吸收特性［25］，在后續(xù)研究中會對其他不同形狀的金納米材料（如金納米棒、金納米籠等）與微納氣泡的結(jié)合進(jìn)行研究，同時(shí)，AuNP也是一種潛在的光聲造影劑，且AuNP-微氣泡復(fù)合材料還可以與其他靶向分子或藥物偶聯(lián)，靶向病灶部位進(jìn)行超聲/光聲成像和光熱/藥物治療，是具有良好應(yīng)用前景的診療一體化載體平臺。