α7煙堿型乙酰膽堿受體基因敲除小鼠牙髓炎模型的構(gòu)建

朱曉東，許 是，蔣 玫，沈天暉，范 益，張光東*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院綜合診療科，2南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程中心，江蘇 南京 210029；4南京市口腔醫(yī)院牙體牙髓科，江蘇 南京 210008；5南京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，江蘇 南京 210029

α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotine acetylcholine receptor，α7 nAChR）作為一種常見的神經(jīng)遞質(zhì)，大量存在于神經(jīng)細(xì)胞中，同時(shí)α7 nAChR 參與的“膽堿能抗炎途徑”能夠在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肺炎、毒血癥等炎癥性疾病中發(fā)揮重要抗炎作用［1-4］。α7 nAChR受體是乙酰膽堿受體的一個(gè)亞型，它是由5 個(gè)相同的α亞基組成并具有獨(dú)特的活化特性和高鈣滲透性，參與了一系列神經(jīng)、精神和炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展過程［5-6］。研究證實(shí)，其抗炎作用的關(guān)鍵靶標(biāo)是炎癥部位免疫細(xì)胞上的α7 nAChR 受體［7］。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的α7 nAChR基因敲除后，上頜骨軟骨及骨髓成骨被抑制［8］。在人類牙周炎與α7 nAChR 的研究中發(fā)現(xiàn)α7 nAChR 可以降低牙周炎癥及減少牙槽骨吸收［9］。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎期的外胚層和成年期牙髓中均有α7 nAChR 的表達(dá)［10］。此外，α7 nAChR 基因敲除鼠在高濃度尼古丁的刺激下，牙槽骨吸收加重，細(xì)菌含量增加［11］。牙髓炎是一種炎癥性疾病，α 7 nAChR是否也在牙髓炎發(fā)生發(fā)展的過程中起到抗炎作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建α7 nAChR KO小鼠上頜第一磨牙牙髓炎模型，為研究α7 nAChR在牙髓炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 材料

40 g/L 水合氯醛（分析純AR，國藥集團(tuán)有限公司）；牙科高速渦輪機(jī)（上海通達(dá)醫(yī)療器械）；牙科手機(jī)（上海通達(dá)醫(yī)療器械）；#20 牙科擴(kuò)孔鉆（登士柏，瑞士）；蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司）；伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司）；正置顯微鏡成像系統(tǒng)（DM4000，徠卡公司，德國）；NLRP3 一抗（Adipogen 公司，美國）；鼠二抗（Thermo Fisher 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8～10 周的α7 nAChR KO 雄性小鼠及WT雄性小鼠各16只（來自于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心范益課題組），12只分為1 d組、3 d組、7 d組進(jìn)行牙髓炎模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)，4只未處理組作為對(duì)照組。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 小鼠牙髓炎模型的構(gòu)建與取材

對(duì)12 只8～10 周的α7 nAChR KO 小鼠及WT 小鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛，進(jìn)行術(shù)前麻醉，注射量為10 mL/kg。小鼠深度麻醉后，手指適當(dāng)按壓小鼠尾尖，在小鼠無明顯運(yùn)動(dòng)狀況下，將小鼠四肢固定至手術(shù)臺(tái)，用橡皮筋將小鼠的上頜切牙固定，放置到顯微鏡下，使用金屬鑷子在下頜切牙處，適當(dāng)拉開下頜和小鼠舌尖，鏡下可清晰觀察到上頜第一磨牙后，用75%的酒精將上頜第一磨牙進(jìn)行消毒，1/4球鉆在渦輪機(jī)低速下磨除牙釉質(zhì)和部分牙本質(zhì)，清洗碎屑后吹干，使用#20 牙科擴(kuò)大針進(jìn)行加壓穿刺，形成洞孔后，停止操作，開放牙髓腔；對(duì)照組4 只小鼠僅麻醉，不進(jìn)行牙髓開放。術(shù)后將小鼠置于37 ℃恒溫板上復(fù)蘇，待小鼠蘇醒后放回原飼養(yǎng)籠。分別在牙髓暴露1 d、3 d、7 d 麻醉小鼠、心臟灌注后，取上頜骨，放入含有多聚甲醛的EP管中進(jìn)行固定。

1.2.3 牙髓組織切片及HE染色

上頜骨固定24～48 h，PBS 沖洗，置于4%EDTA中室溫下脫鈣3～4 周。將標(biāo)本脫水，石蠟包埋制備5 μm 厚的石蠟切片后，進(jìn)行脫蠟、水化、蘇木素-伊紅染色，脫水、透明、封片后鏡下觀察，采集圖像。

1.2.4 免疫組化染色

5 μm石蠟切片，脫蠟、脫水，PBS沖洗；室溫下，3%H2O2孵育30 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗；37 ℃孵箱中1 g/L胰蛋白酶消化30 min暴露細(xì)胞內(nèi)抗原，PBS沖洗；10%胎牛血清封閉30 min后滴加NLRP3（1∶500）一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次；滴加山羊抗兔二抗（1∶500），37 ℃避光孵育1 h，PBS沖洗；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察NLRP3陽性細(xì)胞。觀察正常和炎癥牙髓組織中NLRP3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究測(cè)量的指標(biāo)數(shù)據(jù)都是以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示。免疫組化的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Image J 統(tǒng)計(jì)，GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行Two-Way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組牙髓組織學(xué)表現(xiàn)

α7 nAChR KO 鼠與WT 鼠對(duì)照組牙髓組織中（圖1），釉質(zhì)及牙本質(zhì)完整，高柱狀的成牙本質(zhì)細(xì)胞沿著牙本質(zhì)排列，梭形狀的成纖維細(xì)胞在成牙本質(zhì)細(xì)胞層下方，細(xì)胞間質(zhì)均勻染色，無圓形炎癥細(xì)胞形成。NLRP3免疫組化染色結(jié)果中提示：在牙髓未暴露的情況下，牙髓細(xì)胞的胞質(zhì)中未見陽性結(jié)果。

圖1 小鼠正常牙髓組織學(xué)表現(xiàn)Figure 1 Normal histological appearance of mice dental pulp

2.2 髓腔開放1 d后的組織學(xué)表現(xiàn)

髓腔開放1 d，對(duì)比正常小鼠的牙髓組織（圖2），α7 nAChR KO 鼠及WT 鼠第一磨牙的穿髓點(diǎn)處周圍血管可見少量的圓形炎癥細(xì)胞，同時(shí)比較兩組血管充血及炎癥細(xì)胞，未見明顯差異。NLRP3免疫組化染色結(jié)果顯示，與WT鼠相比，α7 nAChR KO鼠牙髓細(xì)胞胞質(zhì)的陽性染色面積較大。

圖2 牙髓暴露1 d后的組織學(xué)表現(xiàn)Figure 2 The histological appearance of mice dental pulp 1 day after pulp exposure

2.3 髓腔開放3 d后的組織學(xué)表現(xiàn)

髓腔開放3 d，小鼠穿髓孔處細(xì)胞排列紊亂，炎癥細(xì)胞聚集于充血的牙髓血管周圍（圖3）。其中，α7 nAChR KO 鼠中炎癥細(xì)胞聚集到近牙髓腔底部，而WT鼠的炎癥細(xì)胞主要聚集在穿髓孔周圍的牙髓組織。NLRP3免疫組化結(jié)果顯示，α7 nAChR KO 鼠大部分牙髓細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)明顯黃染。

圖3 牙髓暴露3 d后的組織學(xué)表現(xiàn)Figure 3 The histological appearance of mice dental pulp 3 days after pulp exposure

2.4 髓腔開放7 d后的組織學(xué)表現(xiàn)

髓腔開放7 d，組織切片中可見α7 nAChR KO鼠的炎癥細(xì)胞浸潤至根部牙髓組織，而WT 鼠在冠髓底部可見少量殘留的炎癥細(xì)胞（圖4）。同時(shí)，α7 nAChR KO鼠牙髓腔中牙髓細(xì)胞的柱狀細(xì)胞核溶解破碎，形成組織壞死的區(qū)域較大，提示在髓腔開放7 d后α7 nAChR KO 鼠的炎癥發(fā)展較嚴(yán)重。NLRP3 免疫組化染色結(jié)果顯示，α7 nAChR KO 鼠牙髓細(xì)胞的胞質(zhì)全部出現(xiàn)明顯黃染色，細(xì)胞核破碎。

圖4 牙髓暴露7 d后的組織學(xué)表現(xiàn)Figure 4 The histological appearance of mice dental pulp 7 days after pulp exposure

使用Image J 統(tǒng)計(jì)后進(jìn)行雙因素檢驗(yàn)分析（圖5），可見髓腔未暴露前，兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；牙髓暴露1 d、3 d、7 d 后，WT 組與α7 nAChR 組之間NLRP3相對(duì)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 定量分析各組NLRP3的相對(duì)表達(dá)量Figure 5 Quantitative analysis of the relative expression of NLRP3 in each group

3 討論

乙酰膽堿受體是介導(dǎo)突觸間快速信號(hào)傳遞的配體門控離子通道，廣泛分布于肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)中，主要參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，α7 nAChR 是近年來新發(fā)現(xiàn)的nAChR 的亞型。目前，眾多研究發(fā)現(xiàn)，α7 nAChR不僅在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中起到認(rèn)知與減輕疼痛的作用［12-13］，而且可以在肺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病中發(fā)揮一定的抗炎作用［2-4］。牙髓炎是一種以疼痛為主要癥狀的炎癥性疾病，α7 nAChR 可能參與其發(fā)生發(fā)展過程。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)α7 nAChR 在人炎癥牙髓組織中表達(dá)上調(diào)（未發(fā)表）。因此，本研究擬構(gòu)建α7 nAChR KO 小鼠的牙髓炎模型，為研究其在牙髓炎發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

牙髓炎是細(xì)菌產(chǎn)物通過破損的牙體硬組織進(jìn)入牙髓軟組織導(dǎo)致的炎癥性疾?。?4］。湯穎等［15］在Micro-CT 掃描中發(fā)現(xiàn)小鼠上下頜骨的3 個(gè)磨牙中，第一磨牙位置最靠前，牙冠最大。因?yàn)樾∈蟮谝荒パ赖倪@些特點(diǎn)，研究人員用小鼠上頜或者下頜第一磨牙暴露牙髓腔來構(gòu)建牙髓炎模型，觀察牙髓炎的發(fā)生發(fā)展。本研究根據(jù)Shang等［16］和Lee等［17］研究人員的建模方法構(gòu)建小鼠上頜第一磨牙牙髓炎模型。

Kim 等［18］在裸鼠牙髓炎造模實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，牙髓開放1 d后，牙髓血管擴(kuò)張充血；2 d后，小鼠開髓孔和髓腔處開始出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，4 d 后，開髓孔周圍出現(xiàn)炎癥細(xì)胞聚集及輕微的膿腫壞死；7 d 后，牙髓組織出現(xiàn)了明顯的干酪樣壞死。He 等［19］利用WT 小鼠構(gòu)建牙髓炎模型后同樣發(fā)現(xiàn)，髓腔開放3 d，牙髓腔壞死組織明顯，炎癥細(xì)胞聚集，炎癥因子明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)髓腔開放1 d 后，牙髓血管充血擴(kuò)張，髓腔開放3 d 后，炎癥細(xì)胞聚集在穿髓孔周圍；開放7 d 后，組織壞死及細(xì)胞進(jìn)展至根部及冠髓遠(yuǎn)處，與上述研究結(jié)果基本一致，同時(shí)因?yàn)楣诓考?xì)胞核的破碎壞死，導(dǎo)致細(xì)胞胞質(zhì)中NLRP3 表達(dá)量上升。并且本研究發(fā)現(xiàn)將小鼠α7 nAChR基因敲除后，牙髓組織中的炎癥細(xì)胞浸潤速度較快，細(xì)胞核破碎及組織壞死嚴(yán)重。

目前已有研究證實(shí)NLRP3 表達(dá)量在正常與炎癥牙髓組織、牙髓組織與體外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞之間均存在差異，提示其可能在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮作用［20］。小鼠牙髓炎實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在細(xì)菌進(jìn)入牙髓腔后表達(dá)量升高，提示NLRP3炎癥小體參與了牙髓炎的免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，α7 nAChR基因敲除小鼠牙髓暴露后，隨著時(shí)間增加，炎癥逐步加重，同時(shí)NLRP3表達(dá)量也隨之升高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了α7 nAChR KO 小鼠牙髓炎模型，與WT鼠相比，α7 nAChR KO鼠的炎癥發(fā)展速度較快，抗炎能力下降，說明α7 nAChR 可能參與牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程。