B10細(xì)胞在放射性肺纖維化進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化

潘曉嫻，王彩虹，王 锃，陳金梅，2，藍(lán)瑞隆，陳俊英，張緯建，2，黃 菲*，洪金省，2*

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，福建 福州 350005；2福建省高等學(xué)校放射生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；3福建省腫瘤精準(zhǔn)診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；4福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005

胸部腫瘤是臨床上常見的惡性腫瘤，而放射治療是胸部腫瘤綜合治療必不可少的手段，如肺癌、食管癌、縱隔腫瘤等。放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療后常見的不良反應(yīng)［1］，包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）［2］。RIPF 一般發(fā)生于胸部放療的6 個(gè)月后，臨床表現(xiàn)包括呼吸困難、胸痛，嚴(yán)重時(shí)可引起呼吸衰竭甚至死亡。目前RIPF 的治療靶標(biāo)尚不明確，臨床上缺乏有效的治療措施［3］，因此，尋找影響RIPF的靶標(biāo)對(duì)于預(yù)防和治療RIPF具有重要意義。

B10 細(xì)胞是一種可分泌IL-10 的調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）的特殊亞群，參與炎癥、免疫性疾病、腫瘤等多種疾?。?］。近年多項(xiàng)研究證實(shí)B10 細(xì)胞與多種器官纖維化相關(guān)，如病毒引起的肝纖維化［5］、粉塵性肺纖維化［6］、藥物性肺纖維化［7］。然而，粉塵及藥物引起的肺纖維化與電離輻射引起的肺纖維化機(jī)制不盡相同。前期研究發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6 小鼠次全身照射可引起脾臟中的Breg細(xì)胞亞群增加，抑制自身免疫性疾病的發(fā)展［8］。目前尚無研究報(bào)道B10 細(xì)胞與RIPF 相關(guān)聯(lián)。本研究旨在觀察小鼠經(jīng)胸部電離輻射后，B10 細(xì)胞在小鼠RIPF 進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化情況，探討B(tài)10 細(xì)胞與RIPF 之間可能存在的關(guān)聯(lián)，為RIPF 提供新的防治思路。

1 材料和方法

1.1 材料

直線加速器（Clinac600C/D）（Varian醫(yī)療系統(tǒng)公司，美國），流式細(xì)胞儀（Accuri C6）（BD公司，美國）；大鼠抗小鼠CD5-PE（Sigma公司，美國），大鼠抗小鼠CD19-FITC（BioLegend 公司，美國），大鼠抗小鼠CD1d-APC（eBioscience 公司，美國），紅細(xì)胞裂解液（BD公司，美國），60 μm細(xì)胞篩（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取30 只成年雌性6～8 周齡健康、清潔級(jí)C57BL/6 小鼠，體重18～22 g，購自上海斯萊克動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。隨機(jī)分成5 組，分別為未照射（對(duì)照）組、照射后2 d（IR2d）組、照射后14 d（IR14d）組、照射后3個(gè)月（IR3m）組，照射后5 個(gè)月（IR5m）組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)操作符合3R原則，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 照射方式

配制4%水合氯醛以0.1 mL/10 g 腹腔注射麻醉小鼠。將小鼠放入自制有機(jī)玻璃鼠籠中，拉直鼠尾，膠布固定。根據(jù)本單位擺位誤差以及質(zhì)量控制，將照射野設(shè)置為38.0 cm×1.5 cm，將固定好的小鼠整齊排列置于治療床上，照射部位為小鼠胸部，具體擺位操作參考已發(fā)表論文［9］。采用直線加速器（Clinac600C/D）用6 MV-X線單次18 Gy照射小鼠全肺，射野角度180°單野照射，劑量率500 Mu/min。通過劑量體積直方圖（dose volume histogram，DVH）評(píng)估計(jì)算出小鼠肺部百分深度劑量為83%。對(duì)照組相同環(huán)境下予以假照射。

1.2.3 標(biāo)本處理

通過頸椎脫臼法處死各組小鼠，剪取小鼠左側(cè)肺組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定，24 h 后轉(zhuǎn)至75%酒精，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)0.4 μm 切片，通過HE染色、Masson染色、免疫熒光染色行病理學(xué)檢測，顯微鏡下觀察染色情況。另取小鼠整個(gè)脾臟及相同質(zhì)量同側(cè)肺組織，浸泡于含10%血清的PBS緩沖液中備用，待制備單細(xì)胞懸液。

1.2.4 流式細(xì)胞樣本處理及流式分析

研磨組織樣本，60 μm 細(xì)胞篩過濾脾臟/肺組織，1 800 r/min（脾）、2 000 r/min（肺），離心5 min，棄上清，加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液重懸后，以相同轉(zhuǎn)速離心3 min 后，棄上清，5 mL PBS 緩沖液洗滌重懸，離心5 mim，去上清，加入100 μL PBS緩沖液制備成單細(xì)胞懸液。分別加入0.5 μL大鼠抗小鼠的FITCCD19 抗體、APC-CD1d 抗體和PE-CD5 抗體，混勻，4 ℃下避光孵育30 min。上機(jī)，于流式細(xì)胞儀上檢測B10細(xì)胞數(shù)量占比情況。

1.2.5 病理學(xué)評(píng)分

Masson染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨機(jī)在上、下、左、右和中部各選1 個(gè)視野，根據(jù)Ashcroft 纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)分［10］。

免疫熒光評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，采用陽性細(xì)胞占視野總細(xì)胞數(shù)的百分比來評(píng)估表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。方差齊性檢驗(yàn)采用F檢驗(yàn)，對(duì)符合正態(tài)分布且方差齊的3組及3組以上的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，如各組間B10 細(xì)胞比例進(jìn)行單因素多水平方差分析，進(jìn)一步使用Dunnett 法（Dunnett’s multiple comparisons test）行多重比較。對(duì)于僅有兩組的實(shí)驗(yàn)研究，若變量符合正態(tài)分布，使用雙尾、非配對(duì)t檢驗(yàn)分析組間差異；如變量不符合正態(tài)分布，則使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)驗(yàn)證C57BL/6小鼠RIPF模型的構(gòu)建

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤，給予照射后，可見IR2d 組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性浸潤，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。IR14d 組炎性滲出有所吸收。IR3m 組出現(xiàn)肺間質(zhì)填充，肺間隔增寬，正常肺結(jié)構(gòu)被破壞。IR5m組發(fā)現(xiàn)肺泡大量融合，肺間隔增寬明顯，肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著（圖1）。肺組織Masson 染色結(jié)果示，IR5m組大量膠原纖維填充于肺間質(zhì)中，發(fā)生明顯肺纖維化，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t′=-6.006，P＜0.001）。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IR5m 組中肺組織肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（t=8.022，P＜0.01，圖2）。

圖1 單次18 Gy胸部照射后各時(shí)間點(diǎn)的小鼠肺組織HE染色（×100）Figure 1 HE staining of mouse lung tissue at various time points after a single 18 Gy chest irradiation（×100）

圖2 單次18 Gy胸部照射誘導(dǎo)肺纖維化組織的Masson染色及免疫熒光結(jié)果Figure 2 Masson staining and immunofluorescence results of lung fibrosis induced by a single 18 Gy chest irradiation

2.2 RIPF進(jìn)程中肺組織中B10細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化情況

胸部照射后，不同時(shí)間小鼠肺組織中B10 細(xì)胞占全肺細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.230，P＜0.001）。照射后早期B10細(xì)胞浸潤增加，與對(duì)照組相比，照射后2 d（P＜0.01）、14 d（P＜0.05）肺組織中B10 細(xì)胞明顯增加，而照射后3 個(gè)月則較照射后2 d下降明顯（P＜0.05，圖3）。

圖3 電離輻射誘導(dǎo)肺纖維化進(jìn)程中肺組織B10細(xì)胞的浸潤情況Figure 3 Infiltration of B10 cell in lung tissues during the process of radiation-induced pulmonary fibrosis

2.3 RIPF進(jìn)程中脾臟中B10細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化情況

脾組織中，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，照射后不同時(shí)間脾臟中B10 細(xì)胞占全脾細(xì)胞比例不同（F=37.970，P＜0.001）。照射后2 d B10 細(xì)胞開始增加，而照射后14 d時(shí)則達(dá)到峰值（P＜0.001），IR3m組的B10 細(xì)胞則較IR2d 組（P＜0.01）、IR14d 組（P＜0.001）明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 電離輻射誘導(dǎo)肺纖維化進(jìn)程中脾臟組織中B10細(xì)胞的浸潤情況Figure 4 Infiltration of B10 cells in spleen tissue during the process of radiation-induced pulmonary fibrosis

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，Breg 細(xì)胞在矽肺或博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化進(jìn)程中起重要作用［6-7］，而其亞型B10細(xì)胞是否與RIPF 進(jìn)程關(guān)聯(lián)，并且B10 細(xì)胞在RIPF中的動(dòng)態(tài)變化情況，迄今還未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過研究單次18 Gy照射下的RIPF小鼠模型中B10細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化情況，首次發(fā)現(xiàn)在電離輻射誘導(dǎo)的小鼠RIPF 進(jìn)程中，肺組織及脾臟中存在B10 細(xì)胞浸潤，且在炎性早期B10細(xì)胞比例顯著增加，而在纖維化晚期B10細(xì)胞比例逐漸減少。

RIPF 是肺損傷修復(fù)的不良結(jié)果。電離輻射可引起肺上皮細(xì)胞及肺實(shí)質(zhì)發(fā)生損傷，在正常愈合過程中，肺泡-毛細(xì)血管通透性恢復(fù)，炎癥緩解，正常肺受損上皮及實(shí)質(zhì)細(xì)胞修復(fù)。但若肺損傷、炎癥持續(xù)存在，則會(huì)持續(xù)調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答，引起機(jī)體肺損傷修復(fù)過度導(dǎo)致肺的結(jié)構(gòu)紊亂，最終發(fā)展為不可逆的肺纖維化［11-12］。

B細(xì)胞通常被認(rèn)為能增強(qiáng)免疫反應(yīng)，然而，B細(xì)胞也能抑制多種小鼠自身免疫和炎癥模型的免疫反應(yīng)［13］。B10 細(xì)胞作為一類可產(chǎn)生IL-10 的特殊表型CD19+CD5+CD1d+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，發(fā)揮著負(fù)調(diào)節(jié)免疫的作用。在免疫應(yīng)答過程中，炎性分子誘導(dǎo)B10細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生和效應(yīng)功能，可抑制抗原特異性T細(xì)胞的激活和先天巨噬細(xì)胞功能，從而發(fā)揮生物學(xué)功能［14］。研究表明，B10 細(xì)胞具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，即使少量的B10 細(xì)胞也能顯著抑制接觸超敏反應(yīng)［15］、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［16］和移植物抗宿主?。?7］等。此外，近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，B10 細(xì)胞與纖維化有關(guān)，在多種器官組織的纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，然而目前對(duì)B10 細(xì)胞的促纖維化作用和抑制纖維化作用尚有爭議。部分學(xué)者認(rèn)為B10細(xì)胞在纖維化進(jìn)程中起促進(jìn)作用。研究證明，B10細(xì)胞可以通過抑制Th1 反應(yīng)和調(diào)節(jié)Th 平衡來控制肺部炎癥并加劇矽肺誘導(dǎo)的肺纖維化［6］，Liu等［5］發(fā)現(xiàn)患者外周血的Breg 數(shù)量與肝纖維化程度呈正相關(guān)，Komura等［7］提出CD19信號(hào)誘導(dǎo)B細(xì)胞向肺組織浸潤與博萊霉素誘發(fā)的藥物性肺纖維化有關(guān)。而另有一些學(xué)者則發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的肺纖維化中Breg減少［18］。

胸部照射后可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞進(jìn)入肺內(nèi)。其中，B 淋巴細(xì)胞對(duì)電離輻射所致的垂死細(xì)胞釋放出來的DNA 片段異常敏感，其在照射后可迅速地增殖和分化［19］。在正常小鼠中，大多數(shù)CD19+CD5+CD1d+B10細(xì)胞在小鼠脾臟中高度富集，而在其他組織中較少檢測到［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺組織中，未照射對(duì)照組的B10 細(xì)胞數(shù)量處于較低水平，在照射后2 d、14 d 肺組織中B10 細(xì)胞占比明顯增加，且在脾臟中，胸部照射后2 d 也可觀察到B10 細(xì)胞增殖，并且在照射后14 d達(dá)到峰值，我們推測小鼠接受胸部照射后，B10細(xì)胞可能自脾臟募集至肺組織中，參與免疫應(yīng)答，而小鼠脾臟中B10 細(xì)胞則通過增殖分化予以補(bǔ)充。在照射后晚期，脾與肺組織中B10 細(xì)胞也相應(yīng)逐漸減少，這或與小鼠通過自身免疫應(yīng)答損傷修復(fù)，炎癥緩解，肺間質(zhì)重構(gòu)有關(guān)。Cargnoni等［20］發(fā)現(xiàn)可通過減弱B細(xì)胞抗原遞呈減輕Treg細(xì)胞在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的促進(jìn)作用。Lu 等［21］研究發(fā)現(xiàn)B10細(xì)胞可通過釋放IL-10增強(qiáng)Treg功能并促進(jìn)Treg的轉(zhuǎn)化。Xiong等［22］研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）在小鼠胸部照射后數(shù)量明顯增加，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)RIPF的進(jìn)程。這提示B10細(xì)胞可能通過IL-10的分泌促進(jìn)其他效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮促RIPF的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠B10 細(xì)胞可能與RIPF 有關(guān)，且在RIPF 進(jìn)程中，小鼠肺組織、脾臟組織中B10 細(xì)胞比例在纖維化早期明顯升高，而在纖維化晚期則明顯減少。本研究推測B10細(xì)胞可能是影響RIPF重要的免疫細(xì)胞。然而，B10細(xì)胞促進(jìn)或抑制RIPF 尚且不明，且機(jī)制未清，需進(jìn)一步深入研究，為抗RIPF研究提供新思路。