低分子量透明質(zhì)酸通過(guò)CD44 調(diào)控S100A4 核轉(zhuǎn)移促進(jìn)心肌纖維化

馬文杰，洪 牮，朱夢(mèng)琳，孫 燕，錢(qián)麗君，王 凱，李鐘鳴，劉先玲，許 迪*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029；2江蘇省中醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活水平的提高及老齡化社會(huì)的到來(lái)，心血管疾病的發(fā)病率日益上升，心肌纖維化是心血管疾病的一個(gè)重要病理特征，最終可引起心功能不全等一系列嚴(yán)重病理?yè)p害，甚至導(dǎo)致死亡［1］。

細(xì)胞外基質(zhì)沉積是心肌纖維化的主要病理特征，以往心肌纖維化的研究熱點(diǎn)是膠原蛋白，然而除膠原蛋白外，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）也被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分。HA是一種自然形成的多聚糖，廣泛分布于生物體內(nèi)，由透明質(zhì)酸合成酶合成［2］。研究顯示纖維化組織中HA明顯增多，因此HA 被認(rèn)為是心肌纖維化的特征之一，作為心肌纖維化的產(chǎn)物，被動(dòng)參與纖維化的發(fā)生發(fā)展［3］。近年來(lái)隨著對(duì)HA 研究的進(jìn)一步深入，尤其是一些研究證實(shí)HA 不僅是纖維化的產(chǎn)物，更是作為纖維化的驅(qū)動(dòng)因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化與增殖，主動(dòng)參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展［4-6］。上述研究發(fā)現(xiàn)，HA 根據(jù)其不同的分子量而具有不同的功能，目前HA大致可分為3種［7］。初始合成的HA稱為高分子量透明質(zhì)酸（high molecular weight hyaluronic acid，HMW-HA）（＞1 000 kDa），在生理狀態(tài)下HA 以HMW-HA 形式存在，在炎癥刺激或病理狀態(tài)下，HMW-HA 在透明質(zhì)酸酶作用下會(huì)降解為低分子量透明質(zhì)酸（low molecular weight hyaluronic acid，LMW-HA）（6～20 kDa），后者是一種有生物活性的片段［8-10］。研究證實(shí)HMW-HA 具有抗炎作用，保護(hù)細(xì)胞；LMW-HA 則有致炎作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化［9，11］。

研究表明LMW-HA 在細(xì)胞表面的特異性受體為CD44，其廣泛分布于包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞中［12］。在白細(xì)胞中，CD44 與LMW-HA 結(jié)合后僅15 min 即被覆蓋到細(xì)胞的一極，同時(shí)HA 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［9］。LMW-HA 與其受體CD44 相結(jié)合后在調(diào)控細(xì)胞增殖等方面起非常重要的作用［13-14］，多項(xiàng)研究表明CD44 與LMW-HA 相互結(jié)合后可參與肺、肝臟及腎臟組織的纖維化病理進(jìn)程中。細(xì)胞膜表面的CD44 在膜相關(guān)金屬蛋白酶（membrane-associated metalloprotease，MMP）作用下可以被水解，胞外段向血漿和細(xì)胞外液釋放，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則被剪切下，通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮相應(yīng)的功能。近幾年對(duì)核型CD44 的研究主要集中在腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域［15］，研究提示當(dāng)CD44 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)時(shí)可啟動(dòng)下游信號(hào)，使得細(xì)胞發(fā)生程序重調(diào)，從而調(diào)控細(xì)胞分化與增殖［13，16-17］。

S100A4蛋白是S100家族的一員，又稱成纖維細(xì)胞特異性蛋白1，是器官纖維化的分子標(biāo)志物，主要參與細(xì)胞的分化和增殖［18］。在腫瘤、肺、腎臟、肝臟及心臟纖維化組織中明顯表達(dá)，但具體機(jī)制不明［19-20］。本課題組前期研究顯示，缺氧刺激乳大鼠成纖維細(xì)胞及心梗小鼠模型中發(fā)現(xiàn)α-SMA、S100A4、β-catenin、Collegen 1和Collegen 3表達(dá)水平明顯增高。而在心梗組小鼠心肌注射病毒轉(zhuǎn)染S100A4 敲低基因后，Masson 染色提示膠原成分減少，超聲心動(dòng)圖提示小鼠心功能明顯改善［21-22］。上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了S100A4 在心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用。

LMW-HA 與CD44 結(jié)合后可以調(diào)控細(xì)胞增殖，同時(shí)也已證明S100A4與心肌纖維化有關(guān)，因此我們提出假設(shè)：LMW-HA 能夠通過(guò)CD44 作用于S100A4蛋白，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路參與心臟纖維化。

本研究旨在證明LMW-HA 作為心肌纖維化的驅(qū)動(dòng)因子，能促進(jìn)小鼠心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CF）的分化與增殖，并明確其與細(xì)胞膜表面受體CD44 結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)S100A4 蛋白從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，最終促進(jìn)心臟纖維化的發(fā)生，為針對(duì)HA和CD44的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

LMW-HA HA60K-1（Lifecore 公司，美國(guó)）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶、BSA（Gibco 公司，美國(guó)）；RIPA 裂解液、PMSF、DEPC水、DAPI染色液、抗熒光猝滅封片液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（杭州碧云天公司）；青霉素-鏈霉素混合物（HyClone公司，美國(guó)）；Ⅱ型膠原酶（Worthington 公司，美國(guó)）；封閉用羊血清（北京中杉金橋）；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（DOJINDO 公司，日本）；抗HistoneH3、抗α-SMA（CST 公司，美國(guó)），抗CD44（Abcam公司，美國(guó)），BRIC-235（ARP公司，美國(guó)），抗Collagen 3（上海Proteintech 公司），抗GAPDH、抗S100A4、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP（合肥Biosharp 公司），AlexaFluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG、AlexaFluor 594 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美國(guó)）；HiScriptⅢRT Super Mix for QPCR、Cham QSYBR qPCR Master Mix（上海諾唯贊公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

CF 和心肌細(xì)胞（myocardial cell，MC）從南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的出生1～3 d 的SPF 級(jí)ICR 乳小鼠的心臟中分離，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。分離出的細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃、CO2為5%。使用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞傳至第3代后隨機(jī)分組，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 LMW-HA刺激

將LMW-HA 溶于10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基中混勻，CF 用無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜后，換成含有LMW-HA的培養(yǎng)基。

1.2.3 CD44抑制劑處理

將CD44抑制劑BRIC-235提前24 h加入培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2孵育24 h 后換成含有LMW-HA 的培養(yǎng)基。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用胰酶將CF 消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在96 孔板中按照每孔100 μL 3 000個(gè)細(xì)胞的密度加入細(xì)胞懸液，CF貼壁后加入LMW-HA 刺激，一定時(shí)間后換成普通培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。向每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度。

1.2.5 Western blot檢測(cè)

針對(duì)細(xì)胞總蛋白，收取細(xì)胞并且冰上裂解，孵育15 min，刮下蛋白后4 ℃12 000g離心20 min，收集上清液；使用試劑盒分別提取細(xì)胞漿蛋白與核蛋白。應(yīng)用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下5%BSA封閉1 h后，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天二抗孵育2 h，使用ECL 高敏化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)

收取細(xì)胞并用TRIzol 法提取mRNA，用試劑盒對(duì)總mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（37 ℃15 min，85 ℃5 s）合成cDNA。用SYBRGreen 法進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃10 s、60 ℃30 s共40個(gè)循環(huán)，最后退火。采用StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)

CF 傳代至共聚焦培養(yǎng)皿中，37 ℃5%CO2孵育過(guò)夜。第2 天用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100破膜15 min，5%NGS室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床過(guò)夜。第2天吸棄一抗，全程避光，熒光二抗室溫孵育1 h，吸棄二抗，DAPI染核6 min，封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組數(shù)據(jù)均來(lái)自3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS25.0進(jìn)行。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用雙尾未配對(duì)t檢驗(yàn)，多重比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)，所有結(jié)果均使用GraphPad Prism 8.0表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD44與S100A4在CF中高表達(dá)

首先檢測(cè)ICR 乳小鼠CF 和MC 中CD44 和S100A4 mRNA 和蛋白的表達(dá)。qRT-PCR 對(duì)CD44和S100A4 mRNA 進(jìn)行定量分析（圖1A、B），Western blot 對(duì)兩者的蛋白進(jìn)行定量分析（圖1C～E）。結(jié)果表明，CF 中CD44 和S100A4 的表達(dá)量均顯著高于MC（P＜0.01）。

圖1 CD44與S100A4在乳小鼠CF與MC中的表達(dá)Figure 1 Expressions of CD44 and S100A4 in neonatal mice CF and MC

2.2 LMW-HA刺激的最佳濃度

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示（圖2A），分別用不同濃度的LMW-HA 刺激CF，當(dāng)濃度≥0.2 mg/mL 時(shí)CF的增殖與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），0.8 mg/mL LMW-HA 作用下，CF 的增殖最明顯。EdU 染色法同樣證明了0.2 mg/mL 的LMW-HA 已經(jīng)開(kāi)始對(duì)CF的增殖產(chǎn)生影響（圖2B）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.8 mg/mL的LMW-HA對(duì)CF進(jìn)行刺激并培養(yǎng)。

圖2 不同濃度的LMW-HA刺激CF的增殖情況Figure 2 The proliferation of CF stimulated by different concentrations of LMW-HA

2.3 LMW-HA刺激后CF的表型轉(zhuǎn)化

PCR 和Western blot 顯示，CF 中的心肌纖維化標(biāo)志物α-SMA和Collagen 3的表達(dá)在LMW-HA刺激8 h 時(shí)開(kāi)始增加，刺激12 h 時(shí)顯著增加（P＜0.01）；CD44 mRNA 和蛋白的表達(dá)不隨時(shí)間變化（P＞0.05）；LMW-HA刺激8 h后S100A4 mRNA和蛋白表達(dá)時(shí)開(kāi)始緩慢增加（P＜0.05），刺激12 h后顯著增加（P＜0.01，圖3A、B）。采用α-SMA和S100A4細(xì)胞免疫熒光染色觀察到，CF 在LMW-HA 的作用下向肌成纖維細(xì)胞分化（圖3C）。

圖3 LMW-HA刺激后心肌纖維化標(biāo)志物與CD44的表達(dá)量變化Figure 3 The expressions of myocardial fibrosis markers and CD44 after LMW-HA stimulation

2.4 LMW-HA 刺 激使CD44 與S100A4 蛋白從胞漿進(jìn)入胞核

為了研究CD44與S100A4蛋白是否從胞漿進(jìn)入胞核，對(duì)細(xì)胞漿蛋白與核蛋白進(jìn)行分離，然后通過(guò)Western blot 證明，LMW-HA 刺激僅15 min 后，胞漿中的CD44 蛋白表達(dá)量即開(kāi)始降低（圖4A），同時(shí)胞核中的CD44 蛋白逐漸增加（P＜0.05，圖4B），而S100A4 蛋白在30 min 后的變化才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)合總蛋白的表達(dá)，可以得出CD44 蛋白從胞漿進(jìn)入了胞核，而S100A4核蛋白雖然也在合成，但是主要來(lái)源于胞漿。免疫熒光結(jié)果也能印證這2個(gè)蛋白的核轉(zhuǎn)移（圖4C）。

圖4 LMW-HA刺激對(duì)CD44與S100A4蛋白核轉(zhuǎn)移的影響Figure 4 Effects of LMW-HA stimulation on nuclear translocation of CD44 and S100A4 proteins

2.5 CD44 抑制劑存在時(shí)LMW-HA 刺激后CF 的表型轉(zhuǎn)化

PCR和Western blot結(jié)果均顯示，BRIC-235本身對(duì)細(xì)胞無(wú)影響，不會(huì)導(dǎo)致CF中的心臟纖維化標(biāo)志物的增加（P＞0.05，圖5）。同時(shí)LMW-HA的刺激纖維化作用被逆轉(zhuǎn)，α-SMA、Collagen 3和S100A4的表達(dá)不增加，CD44的表達(dá)依然不變（P＞0.05）。

圖5 BRIC-235對(duì)成纖維細(xì)胞中心肌纖維化標(biāo)志物及S100A4表達(dá)的影響Figure 5 Effects of BRIC-235 on expressions of myocardial fibrosis markers and S100A4

2.6 BRIC-235 能抑制CD44 與S100A4 蛋白從胞漿進(jìn)入胞核的過(guò)程

Western blot 結(jié)果顯示，BRIC-235 預(yù)處理細(xì)胞24 h，無(wú)論是否有LMW-HA的存在，胞漿和胞核中的CD44 和S100A4 蛋白的表達(dá)量均沒(méi)有改變（P＞0.05，圖6A、B）。免疫熒光結(jié)果也證明了其對(duì)CD44和S100A4蛋白核轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖6C）。

3 討論

心肌纖維化是眾多心血管疾病及心臟老化的一個(gè)重要的病理特征，導(dǎo)致的心室重構(gòu)會(huì)嚴(yán)重影響心功能，目前藥物治療主要圍繞阻斷神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)抑制心室重構(gòu)來(lái)展開(kāi)［23］，已知血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑均有逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，但其確切效果并不佳；此外，干細(xì)胞移植和基因治療研究正在逐步深入，但療效尚不確切［24］。因此尋找抑制心肌纖維化逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的新靶點(diǎn)迫在眉睫。

近年來(lái)細(xì)胞微環(huán)境的作用頗受關(guān)注。HA 是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，本研究首先明確相較于MC，CF 中的CD44 與S100A4 高表達(dá)，因此選擇CF作為研究對(duì)象。接著，本研究發(fā)現(xiàn)LMW-HA可促進(jìn)CF 的表型轉(zhuǎn)化，刺激8 h 后開(kāi)始分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化。進(jìn)一步研究提示，LMW-HA刺激CF后1 h，細(xì)胞核內(nèi)的S100A4明顯增多同時(shí)胞漿內(nèi)的S100A4減少，并且細(xì)胞膜表面的特異性受體CD44 也有此種趨勢(shì)。我們根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，LMW-HA 促進(jìn)CF 纖維化的機(jī)制可能與CD44 的結(jié)合及S100A4的核轉(zhuǎn)移相關(guān)。最后為明確該假設(shè)，本研究使用了CD44 抑制劑BRIC-235 重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CF 向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化被抑制，同時(shí)CD44 與S100A4 的核轉(zhuǎn)移也未發(fā)生，表明LMW-HA促進(jìn)CF 纖維化的機(jī)制是與CD44 結(jié)合并介導(dǎo)S100A4的核轉(zhuǎn)移。

CD44 是表觀分子量85 kDa 的細(xì)胞膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于選擇蛋白，其細(xì)胞外部分包含N 端二硫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和O 端糖基化的結(jié)構(gòu)域。CD44是HA 的主要細(xì)胞表面受體，其COOH 末端的52 個(gè)氨基酸對(duì)HA 與CD44 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合至關(guān)重要［25］。BRIC-235 作為CD44 的特異性抗體，可抑制HA與CD44的結(jié)合［26］。因此，BRIC-235具有作為心肌纖維化靶向治療的潛力，可以阻斷LMW-HA 與CD44的結(jié)合，抑制CF向肌成纖維細(xì)胞分化。

本研究一方面創(chuàng)新性地提出HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，不僅是心肌纖維化的產(chǎn)物，更是作為纖維化的驅(qū)動(dòng)因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分化與增殖，主動(dòng)參與到心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中，為我們更好地理解心肌纖維化的病理機(jī)制提供了新思路。另一方面，心肌纖維化的治療一直是心血管疾病治療中的難點(diǎn)，而首次提出LMW-HA/CD44 通過(guò)促進(jìn)S100A4 核轉(zhuǎn)移，與CD44 結(jié)合調(diào)節(jié)下游通路從而促進(jìn)纖維化的機(jī)制，為將來(lái)進(jìn)一步闡述缺血性心肌纖維化分子機(jī)制打下了研究基礎(chǔ)，也為今后臨床分子治療提供理論基礎(chǔ)和新的靶點(diǎn)。

然而，本研究依然有需要改進(jìn)之處。首先，由于條件限制及時(shí)間緊張，本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑽茨軐?shí)現(xiàn)，未能進(jìn)一步探討病理狀態(tài)下HA 分解代謝對(duì)心功能的影響，以及相關(guān)分子治療的安全性和有效性。其次，CD44 與S100A4 在細(xì)胞核內(nèi)是通過(guò)激活何種下游通路來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖，目前在心肌纖維化的領(lǐng)域尚無(wú)定論，需要更深入的研究。

綜上所述，LMW-HA 具有高度致炎作用，而其與成纖維細(xì)胞膜特異性受體CD44結(jié)合后進(jìn)一步形成了纖維化的驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)誘導(dǎo)S100A4蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化從而誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生。