氣相色譜電子捕獲法在檢測(cè)藥品中氯代乙烷類(lèi)毒性雜質(zhì)中價(jià)值

薛毅博，孫紅濤，王佳佳

駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所藥理室，河南 駐馬店 463000

藥品中的雜質(zhì)，為無(wú)任何療效的物質(zhì)，且可能引起患者出現(xiàn)副作用［1］。因此，必須嚴(yán)格控制雜質(zhì)水平，以確保藥品的安全性達(dá)到人體用藥的要求。根據(jù)ICH指南［2］，原料藥的雜質(zhì)主要分為有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑三個(gè)類(lèi)別，而在這三類(lèi)中，遺傳毒性雜質(zhì)安全閾值較低，甚至在低濃度的情況下發(fā)生突變，從而可能損傷DNA［3］。Benigin等［4］歸納總結(jié)了具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)。但目前，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于藥品中氯代乙烷類(lèi)化合物含量的檢測(cè)方法。氣相色譜儀電子捕獲檢測(cè)器是一個(gè)選擇性較好、靈敏度超高的檢測(cè)器，它只對(duì)含鹵素、硫、磷等的物質(zhì)有超強(qiáng)的信號(hào)，并且要檢測(cè)的物質(zhì)電負(fù)性越強(qiáng)，它的檢測(cè)靈敏度也就越高［5］。SYL930［6］是一種選擇性S1P1受體激動(dòng)劑，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研發(fā)，由于它可以明顯改善體內(nèi)的外周血淋巴細(xì)胞水平，所以通常用于對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的治療，但在合成SYL930的過(guò)程中很可能產(chǎn)生氯代乙烷類(lèi)毒性雜質(zhì)。因此，本研究建立了一種氣相色譜電子捕獲法分析方法，同時(shí)檢測(cè)SYL930原料藥中可能存在的1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等3種氯代乙烷類(lèi)毒性雜質(zhì)，靈敏度較高，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

儀器：帶有ECD的氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司），DB-624（30 m×0.53 mm，3.0μm）色譜柱（北京慧安清檢測(cè)科技有限公司），MSA225S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

藥品：1，2-二氯乙烷（GCS，99.6%）、1，1，2，2-四氯乙烷（GCS，99.9%）、1，1-二氯乙烷（GCS，99.5%）；N-甲基吡咯烷酮（NMP，色譜純，99.5%）；SYL930原料藥（批號(hào)：SNT20140402，SNT20140404）。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱的起始柱溫設(shè)置為35℃，溫度持續(xù)4 min以后，以15℃/min的速度快速升到100℃，然后以20℃/min的速度升高溫度到230℃，持續(xù)20 min。之后采用純度≥99.99%的高純氮?dú)?，柱的流速設(shè)置為4.5 mL/min，分流比設(shè)置為5∶1，立即進(jìn)樣，進(jìn)藥量為1μL。

2.2 制備溶液

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)量1，2-二氯乙烷100 mg，放入50 m L量瓶中，之后用NMP定容并搖勻得到1，2-二氯乙烷溶液。精密稱(chēng)量1，1，2，2-四氯乙烷10 mg，置于100 mL量瓶中，用NMP定容并充分搖勻后將該溶液定量稀釋100倍，制得1，1，2，2-四氯乙烷溶液。精密稱(chēng)量1，1-二氯乙烷100 mg，放到10 mL量瓶后用NMP定容，充分搖勻后制得1，1-二氯乙烷溶液。

2.2.2混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取上述的1，2-二氯乙烷溶液、1，1-二氯乙烷溶液各1 mL，并精密量取1，1，2，2-四氯乙烷溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，之后用NMP定容至刻度并充分搖勻制得混合對(duì)照品溶液。精密量取1 mL上述混合對(duì)照品溶液放入10 mL量瓶中，然后用NMP定容并充分搖勻后制得混合的對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)量200 mg供試品倒入1 mL量瓶中，然后用適量的NMP溶液進(jìn)行超聲溶解處理，之后用NMP定容至刻度并充分搖勻得到供試品溶液。

2.2.4系統(tǒng)適用性溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)量200 mg供試品放于1 mL量瓶中，精密量取0.1 mL上述混合對(duì)照品溶液后倒入到上述量瓶中，然后用NMP定容至刻度并充分搖勻后制得系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 溶液穩(wěn)定性的檢測(cè)

取適量的上述混合對(duì)照品溶液，按照上述“2.1”項(xiàng)的色譜條件，每隔2 h測(cè)定一次，共測(cè)12次，即24小時(shí)，分別記錄氯代乙烷類(lèi)化合物各組分的峰面積，結(jié)果顯示1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷的RSD值分別為1.8%，0.89%，1.6%，表明在24 h內(nèi)混合對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

精密量取上述混合對(duì)照品溶液，按照不同比例用NMP定量稀釋此溶液，制得不同濃度混合對(duì)照品溶液，然后按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定后得到3種化合物的色譜圖，峰面積作為縱坐標(biāo)，各化合物的濃度作為橫坐標(biāo)，采用線(xiàn)性回歸分析方法，見(jiàn)表1。

表1 氯代乙烷類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5 精密度的測(cè)定

分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，將每種溶液按照不同比例定量稀釋成高、中、低3種不同濃度的溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，并且每種濃度的溶液平行4份，詳細(xì)記錄色譜峰并用峰面積來(lái)計(jì)算精密度大小，見(jiàn)表2。

表2 氯代乙烷類(lèi)化合物的精密度

2.6 最小檢測(cè)限和最小定量限

取適量的上述混合對(duì)照品溶液，用NMP稀釋得到適當(dāng)濃度的溶液，以“2.1”項(xiàng)色譜操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)樣，以信噪比（S/N）作為樣品的最小檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)，以各個(gè)組分線(xiàn)性范圍的最低濃度表示化合物的最小定量濃度。取適量的氯代乙烷類(lèi)化合物溶液后定量稀釋至3種化合物濃度均為定量限的15倍，得到驗(yàn)證溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)量供試品200 mg，放入1 mL量瓶后取適量的NMP進(jìn)行超聲溶解處理，加入100μL上述驗(yàn)證溶液，加NMP到刻度處，充分搖勻后按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，見(jiàn)表3。

表3 氯代乙烷類(lèi)化合物的最小檢測(cè)限和最小定量限

2.7 含量的檢測(cè)

精密稱(chēng)取200 mg供試品放到1mL量瓶中，平行實(shí)驗(yàn)3份，采取適量的NMP進(jìn)行超聲溶解處理后，再用NMP稀釋至刻度并充分搖勻，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，詳細(xì)記錄色譜圖，采用外標(biāo)法來(lái)計(jì)算峰面積，以此來(lái)表示含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在原料藥SYL930中未檢測(cè)出含有1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等毒性雜質(zhì)。

3 討論

本研究建立了SYL930原料藥中1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等氯代乙烷類(lèi)化合物的氣相色譜電子捕獲法檢測(cè)，優(yōu)化了色譜的檢測(cè)條件。

本研究采用DB-624色譜柱，因?yàn)樵撋V柱峰形對(duì)稱(chēng)且比較窄，無(wú)拖尾現(xiàn)象［7］，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氯代乙烷類(lèi)化合物的有效分離；本研究采用ECD檢測(cè)器，因?yàn)橐蛛x的化合物含有氯原子，在該檢測(cè)器上比較靈敏。本研究采用以15℃/min升溫，因?yàn)楫?dāng)以15℃/min升溫時(shí)，氯代乙烷類(lèi)化合物的各組分形成的峰形較窄，并且可以實(shí)現(xiàn)氯代乙烷類(lèi)化合物與NMP和供試品中的雜質(zhì)峰分離完全［8］；本研究對(duì)于溶液的制備，采用準(zhǔn)確稱(chēng)量、精密量取的操作方法，用NMP定容至刻度，目的是使檢測(cè)結(jié)果更可靠、更具有說(shuō)服性；本研究采用5:1的分流比，因?yàn)檫M(jìn)藥量過(guò)大會(huì)引起色譜的污染且還會(huì)引起基線(xiàn)噪聲的增加［9］。本研究發(fā)現(xiàn)1，1，2，2-四氯乙烷在2.096～42.56 ng/mL、1，1-二氯乙烷在0.1078～10.69μg/mL、1，2-二氯乙烷在0.02136～2.136μg/m L范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系均良好，且相關(guān)系數(shù)均大于0.999；上述三種化合物的在低、中、高濃度的RSD值0.9%～4.7%，說(shuō)明該方法精密度良好；1，1-二氯乙烷的最小檢測(cè)濃度為27 ng/m L、最小檢測(cè)限度為0.83μg/g，相比于其他兩種化合物均較高，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)原料藥中的3種氯代乙烷類(lèi)化合物最小定量限均＜1 ppm，且信噪比＞10，符合檢測(cè)基因毒性雜質(zhì)的需要［10］，可十分有效地檢測(cè)原料藥中的各組分，從而可以檢測(cè)藥物的有毒雜質(zhì)。

綜上所述，故采用氣相色譜電子捕獲法、用DB-624色譜柱建立的方法檢測(cè)氯代乙烷類(lèi)毒性雜質(zhì)專(zhuān)屬性良好、靈敏度較高、準(zhǔn)確度和精密度較好，值得推廣應(yīng)用。