參紅通絡(luò)方對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響*

靳宏光，朱星，李鐵，王義強(qiáng)，成光宇

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心病中心，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿研究所，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心，長春 130021)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康，降低患者生活質(zhì)量。長期以來AS發(fā)病機(jī)制一直備受關(guān)注，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AS是一種慢性炎癥性疾病，CD40/CD40 配體(CD40/CD40L)是一對(duì)互補(bǔ)跨膜糖蛋白，是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)過程中重要的信號(hào)通路[1]，貫穿AS整個(gè)發(fā)病過程。參紅通絡(luò)方是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣活血、豁痰通絡(luò)作用。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察參紅通絡(luò)方對(duì)AS大鼠粥樣硬化斑塊的影響，以揭示該藥治療AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(280±20) g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2017-0005。大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)室，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，通風(fēng)良好。大鼠基礎(chǔ)飼料配方：面粉20%、米粉3%、玉米25%、麩皮25%、豆料20%、骨粉3%、魚粉4%。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料77%、膽固醇3%、蛋黃粉10%，豬油10%。先將基礎(chǔ)飼料與膽固醇、蛋黃粉、豬油充分混合，攪拌均勻，加入適量開水制成模餅，微波爐烤干?；A(chǔ)飼料、膽固醇、蛋黃粉、豬油均由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2藥物與試劑 參紅通絡(luò)方：由人參、紅景天、瓜蔞、半夏、丹參、水蛭、降香等藥物組成，本實(shí)驗(yàn)采用其免煎農(nóng)本顆粒(由吉林省萊沃藥業(yè)有限公司提供，藥品與批號(hào)分別為人參A1701100、紅景天A1601745、瓜蔞A1601059、清半夏A1700452、丹參A1601972、水蛭A1701020、降香A1600538)；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：J20130068 ，規(guī)格：每片20 mg)；低分子肝素鈉(商品名：吉派林，杭州九源基因工程有限公司，規(guī)格：每瓶0.3 mL，批號(hào)：160406)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，規(guī)格：每瓶80萬U，批號(hào)：20170529)。

氧化低密度脂蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(oxidation low lipoprotein enzyme linked immunosorbent assay，ox-LDL ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181120)；可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)ELISA試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：208180418)；抗腫瘤壞死因子-α(anti-tumor necrosis factor，Anti-TNF-α，兔抗大鼠，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗血管細(xì)胞黏附分子1(anti-vascular cell adhesion molecule-1，anti-VCAM-1，兔抗大鼠，博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BST17274289)；二氨基聯(lián)苯胺3(3’-diaminobenzidine，DBA)顯色液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20181120)；0.5%聚山梨酯-20的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)，美國Santa Curz生物工程公司)；辣根酶標(biāo)記羊抗鼠抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：134560)；辣根酶標(biāo)記羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：136080)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：82418180930)；鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶[寶生物工程(大連)有限公司]；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、CD40、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，批號(hào)：1914526843。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 JJ260電子記重秤(AWH)；4K15低溫高速離心機(jī)(Heraeus)；TD-5M小型臺(tái)式離心機(jī)(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司)；AB×51光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；PM-10AO全自動(dòng)顯微照相裝置(Olympus)；HHW21600電熱恒溫水浴箱(上海量壹科學(xué)儀器有限公司)；LKB～V型超薄切片機(jī)(瑞士LKB)；JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)有限公司)；CFX96TM Real-Time system熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀(美國Bio-Rad公司)；04113R115669轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad)；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；KD-12-A(JY-18)高壓滅菌器(浙江凱德醫(yī)療器械有限公司)；SW-CJ-2FD無菌超凈操作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電泳儀(Eps600)；722s紫外可見分光計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(上海Tanon科技有限公司)；T10型勻漿機(jī)(德國IKA)；U570-86 -80 ℃超低溫冰箱(英國New Brunswick Scientific)。

1.4動(dòng)物的分組與造模 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組16只：假手術(shù)組、模型對(duì)照組、中藥小劑量組、中藥大劑量組、辛伐他汀組。

參考文獻(xiàn)[2]方法，假手術(shù)組結(jié)扎頸外動(dòng)脈，不行球囊損傷術(shù)，其余各組用球囊損傷主動(dòng)脈。所有大鼠麻醉后仰臥固定，頸部備皮，取頸部正中偏左3 mm 切開皮膚，切口長 2.5～3.5 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉。左側(cè)頸總動(dòng)脈下穿2根4號(hào)絲線，結(jié)扎遠(yuǎn)端，另一根線放置近端備用。在靠近血管遠(yuǎn)端結(jié)扎處，剪一“V”型小口。假手術(shù)組直接在小口近心端結(jié)扎，其余各組大鼠用準(zhǔn)備好的球囊沿小口處插入頸外動(dòng)脈，繼續(xù)順著血管往下插，經(jīng)過頸總動(dòng)脈到達(dá)主動(dòng)脈，調(diào)節(jié)壓力泵以200～600 kPa擴(kuò)張球囊，放松絲線，恢復(fù)血液供應(yīng)，來回緩慢抽動(dòng)球囊3次后撤出球囊，靠近頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，抽去頸總動(dòng)脈處絲線，恢復(fù)動(dòng)脈血流，查看頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈是否充盈搏動(dòng)良好。各組大鼠均用聚維酮碘溶液清洗組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，逐層縫合。術(shù)后預(yù)防性給予青霉素 20萬U皮下注射，連用3 d；低分子肝素鈉注射液521 U·kg-1皮下注射，連用3 d。術(shù)后普通飼料飲食，自由飲水1周。

術(shù)后第2周，除假手術(shù)組仍給予普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，球囊損傷+高脂飲食喂養(yǎng)6周后，大鼠膽固醇及三酰甘油水平明顯升高，頸總動(dòng)脈蘇木精-伊紅(HE)染色出現(xiàn)粥樣硬化斑塊，提示造模成功。

1.5給藥方法 造模成功后，中藥小劑量組、中藥大劑量組分別給予參紅通絡(luò)方免煎農(nóng)本顆粒7.15和28.60 g·kg-1·d-1，溶于溫水2 mL灌胃；辛伐他汀組給予辛伐他汀1 mg·kg-1·d-1，溶于溫水2 mL灌胃；假手術(shù)組、模型對(duì)照組給予等容積0.9%氯化鈉溶液灌胃。均每天1次，連續(xù)8周，以上劑量均按《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》人、鼠劑量轉(zhuǎn)換公式換算。

1.6觀察指標(biāo)與測定方法 血清樣品的制備：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘眼球取血，室溫放置30 min～2 h，血清析出后3000 r·min-1(r=15 cm)離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)脈標(biāo)本的取材：將取完血清的大鼠處死，取損傷部位動(dòng)脈，截取1～2 cm置于4%多聚甲醛備用，剩余部分置微型離心(eppendorf，EP)管，-80 ℃冰箱保存待測。

大鼠血清ox-LDL、sCD40L的測定：從冰箱取出 ELISA試劑盒及血樣，室溫復(fù)溫約30 min，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

頸總動(dòng)脈病理形態(tài)觀察：將頸總動(dòng)脈置4%多聚甲醛固定液48～72 h，0.1 mol·L-1中性磷酸鹽緩沖液(PBS)液充分洗滌，過夜，修復(fù)組織塊，梯度乙醇，二甲苯、浸蠟Ⅰ1、Ⅱ處理，石蠟包埋，LKB～V型超薄切片機(jī)切片，厚3～4 μm，每塊組織切5片，以防損壞備用。病理攤烤片機(jī)干燥，切片后HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

免疫組化法觀察斑塊細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、TNF-α表達(dá)：①操作步驟，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，SP)法檢測)，a.頸總動(dòng)脈組織修塊固定，脫水透明，石蠟包埋切片；b.PBS(0.01 mol·L-1，pH值7.5±0.1)沖洗；c.對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)修復(fù)；d.每張切片加過氧化氫酶阻斷溶液(H2O2)，室溫孵育10 min，PBS沖洗；e.除去PBS液，每張切片加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育；f.除去血清，每張切片加第一抗體；g.PBS沖洗，每張切片加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育，PBS沖洗；h.除去PBS液，每張切片加第三抗體鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育，PBS沖洗；i.除去PBS液，每張切片加氧化二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液，顯微鏡下觀察；j.純化水沖洗，蘇木精復(fù)染，水洗，氨水返藍(lán)。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。②結(jié)果的判定：以光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或棕褐色為陽性著色。按陽性染色細(xì)胞所占比例分為3級(jí)：陽性染色細(xì)胞占15%～35%為弱陽性反應(yīng)(+)；陽性染色細(xì)胞占36%～75%為陽性反應(yīng)(++)；陽性染色細(xì)胞占75%以上為強(qiáng)陽性反應(yīng)(+++)；將免疫組化切片置顯微鏡下，免疫組化反應(yīng)顯色強(qiáng)度JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并測定頸總動(dòng)脈內(nèi)皮ICAM-1、TNF-α灰度值(即反映組織化學(xué)染色產(chǎn)物深淺程度：灰度值越大，則反映產(chǎn)物濃度越小，反之，濃度越大)，每張切片取視野5個(gè)，取平均值。

AS斑塊內(nèi)CD40mRNA及IL-1B mRNA表達(dá)：①RNA的提取，取凍存大鼠頸總動(dòng)脈50 mg，置研缽中迅速在液氮中研成粉末，采用Total RNA提取試劑常規(guī)提取總RNA，DNase I(RNase Free)進(jìn)行DNA消化。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL合成cDNA。③Real-Time PCR反應(yīng)：取反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增以GAPDH基因表達(dá)作為內(nèi)參照，GAPDH上游引物序列：5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，下游引物序列：5′-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG -3′；CD40上游引物序列：5′-ATACCCTCTGTGGTTTCCAGC-3′，下游引物序列：5′-TCCTTTGGTTTGACCACC-3′；IL-1β引物序列：上游5′-CGATGGTCCCAATTACATGA-3′，下游：5′-TTGTAGGGTTGGCAGGAGAT-3′，Real-time PCR反應(yīng)體系20 μL，含SYBRP remixExTaqTM (×2)10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L-1)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，ROX Reference Dye (×50)0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。多次循環(huán)，變性、退火、延伸，每個(gè)樣本重復(fù)3次。Real-time PCR儀數(shù)據(jù)分析軟件(SDDS，Version 1.3，Taq Man)得出CD40、IL-1β和GAPDH的CT值。

2 結(jié)果

2.1一般情況 隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長，各組大鼠體質(zhì)量均增加，假手術(shù)組大鼠反應(yīng)靈敏，進(jìn)食飲水正常，毛色潤澤，體質(zhì)量增長，精神狀態(tài)良好；模型對(duì)照組反應(yīng)較遲鈍，喜蜷縮，毛色暗沉，體質(zhì)量增長較少。其他組大鼠反應(yīng)、進(jìn)食、毛色、精神方面均優(yōu)于模型對(duì)照組。

2.2大鼠死亡情況 球囊損傷術(shù)前假手術(shù)組死亡1只，考慮死亡原因可能為麻醉藥不耐受。球囊損傷術(shù)后假手術(shù)組、辛伐他汀組、中藥大劑量組各死亡3只，模型對(duì)照組、中藥小劑量組各死亡2只，考慮死因可能為手術(shù)牽拉迷走神經(jīng)導(dǎo)致腸梗阻。高脂飲食飼喂過程中，模型對(duì)照組、中藥小劑量組大鼠各死亡1只。最終假手術(shù)組存活12只，其他4組各存活13只。

2.3ox-LDL與sCD40L測定結(jié)果 見表1。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠血清ox-LDL、sCD40L含量均顯著升高 (P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L含量均不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，中藥大劑量組與辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L降低程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 5組大鼠ox-LDL與sCD40L測定結(jié)果Tab.1 Determination of ox-LDL and sCD40L in five groups of rats

2.4頸總動(dòng)脈病理形態(tài) 結(jié)果見圖1。假手術(shù)組頸總動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜連續(xù)，平滑肌細(xì)胞及彈力纖維板排列整齊；模型對(duì)照組頸總動(dòng)脈結(jié)構(gòu)破壞明顯，可見大量泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，中膜層明顯萎縮，平滑肌細(xì)胞排列明顯紊亂，彈力纖維板呈波浪狀排列，板間間隙增大，部分呈斷裂狀態(tài)；中藥小劑量組頸總動(dòng)脈內(nèi)膜較不光滑，內(nèi)皮下可見中等量泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞排列較紊亂，彈力板間隙變大，但該組病理變化較模型對(duì)照組明顯減輕；辛伐他汀組、中藥大劑量組頸總動(dòng)脈病變顯著減輕，內(nèi)膜較光滑，彈力纖維板間隙增大不明顯，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，未見明顯泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。

圖1 5組大鼠頸總動(dòng)脈HE染色(×200)Fig.1 HE staining on common carotid arteries in five groups of rats(× 200)

2.5斑塊中ICAM-1表達(dá)情況 結(jié)果見圖2。假手術(shù)組頸總動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)清晰，幾乎無染成黃色的ICAM-1存在；模型對(duì)照組大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮局部可見大量ICAM-1表達(dá)，其他各組大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜可見ICAM-1表達(dá)，但顯著少于模型對(duì)照組。

圖2 5組斑塊中ICAM-1表達(dá)情況 (×200)Fig.2 ICAM-1 expression in the plaques of five groups of rats(× 200)

2.6斑塊中TNF-α表達(dá)情況 見圖3。假手術(shù)組大鼠頸總動(dòng)脈未見TNF-α表達(dá)，模型對(duì)照組大鼠頸總動(dòng)脈TNF-α表達(dá)明顯，其他各組大鼠頸總動(dòng)脈棕黃色顆粒較模型對(duì)照組顯著減少，提示TNF-α表達(dá)明顯降低。

圖3 5組斑塊中TNF-α表達(dá)情況(×200)Fig.3 TNF- α expression in the plaques of five groups of rats(× 200)

2.7斑塊中CD40mRNA表達(dá)情況 見圖4。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組斑塊內(nèi)CD40mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組、中藥大劑量組、中藥小劑量組斑塊中CD40mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，其中中藥大劑量組略小于辛伐他汀組與中藥小劑量組。

2.8AS斑塊內(nèi)IL-1βmRNA表達(dá)情況 見圖5。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組斑塊內(nèi)IL-1βmRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組、中藥小劑量組斑塊內(nèi)IL-1βmRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥大劑量組斑塊內(nèi)IL-1βmRNA降低更顯著(P<0.01)。

①與假手術(shù)組比較，t=13.387，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=3.617～5.120，P<0.01。圖4 5組斑塊中CD40 mRNA相對(duì)表達(dá)①Compared with sham operation group，t=13.387，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.617-5.120，P<0.01.Fig.4 The mRNA expression of CD40 in the plaques of five groups of

①與假手術(shù)組比較，t=6.072，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=2.091～3.158，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，t=4.138，P<0.01。圖5 5組斑塊內(nèi)IL-1β mRNA表達(dá)情況①Compared with the sham operation group，t=6.072，P<0.01；②Compared with the model control group，t=2.091-3.158，P<0.05；③Compared with the model control group，t=4.138，P<0.01.Fig.5 The mRNA expression of IL-1β in the plaques of five groups of

3 討論

CD40/CD40L通路是重要的免疫炎癥反應(yīng)通路，在非疾病狀態(tài)下，CD40、CD40L處于不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)，遇到炎癥等刺激會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)量顯著上調(diào)。CD40L與CD40配接成功后激活CD40，促使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與TNF受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factors，TRAFs)銜接[3-4]，CD40與TRAFs銜接完成后，促使下游黏附分子(如ICAM-1)、炎癥因子(如IL-1β和TNF-α等)等大量釋放，為AS發(fā)生發(fā)展提供強(qiáng)大動(dòng)力。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，抑制CD40/CD40L信號(hào)通路及其相關(guān)信號(hào)分子能有效延緩AS進(jìn)程[5-8]。

LOX-1是ox-LDL結(jié)合的重要位點(diǎn)，與ox-LDL結(jié)合后可以激活CD40/CD40L通路，極大促進(jìn)活性氧物質(zhì)及炎癥因子釋放，嚴(yán)重?fù)p害血管內(nèi)皮功能，對(duì)泡沫細(xì)胞的形成及內(nèi)膜增生具有推動(dòng)作用[9]，并能破壞線粒體DNA，參與血管細(xì)胞凋亡和自噬[10]。臨床研究顯示，黏附分子與冠心病和急性心肌梗死有關(guān)，可以作為疾病診斷、治療及評(píng)估預(yù)后的參考指標(biāo)[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，黏附分子缺乏避免了免疫成分細(xì)胞的黏附及遷移，也顯著減輕了LDL-/-鼠AS損傷[12]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的對(duì)腫瘤細(xì)胞有極強(qiáng)殺傷力的小分子生物活性蛋白。動(dòng)物研究顯示，ApoE-/-小鼠注射TNF-α后內(nèi)皮細(xì)胞LDL轉(zhuǎn)胞吞作用增強(qiáng)，LDL顆粒在血管壁沉積增多[13]，刺激了AS產(chǎn)生。同時(shí)TNF-α通過刺激白細(xì)胞介素及趨化因子等的釋放，激活嗜中性粒細(xì)胞，促使炎癥細(xì)胞在損傷部位的聚集，并參與血栓形成、血管重塑、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等多個(gè)環(huán)節(jié)，加劇AS病變[14-15]。抑制TNF-α可能對(duì)亞臨床AS具有預(yù)防作用，并可能延緩AS進(jìn)展[16]。IL-1β通常以無活性前體形式存在，遭遇炎癥刺激后經(jīng)Caspase-1酶剪切活化[17]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β對(duì)于泡沫細(xì)胞的形成具有明顯推動(dòng)作用[18]，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種黏附分子，增強(qiáng)免疫炎癥反應(yīng)，同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞活性及APC抗原遞呈能力具有顯著提升作用，還能刺激蛋白分解酶產(chǎn)生[19]，可以說IL-1β是一種強(qiáng)有力的免疫炎癥刺激因子，影響AS發(fā)展。應(yīng)用IL-1β單克隆抗體能明顯減少ApoE-/-小鼠斑塊數(shù)量。不僅如此，一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰藥對(duì)照的大型臨床試驗(yàn)亦顯示，IL-1β抑制藥康納單抗能顯著降低心肌梗死患者炎癥反應(yīng)，使AS患者心血管終點(diǎn)事件下降15%[20]，表明降低IL-1β含量可能成為防治AS的有效方法。上述研究表明，CD40/CD40L通路與AS密切相關(guān)，LOX-1、CD40、CD40L作為通路上游信號(hào)，ICAM-1、sCD40L、TNF-α、IL-1β作為通路下游信號(hào)，在CD40/CD40L通路整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，這些信號(hào)分子表達(dá)上調(diào)時(shí)刺激AS發(fā)生，抑制這些信號(hào)分子的表達(dá)則有利于延緩AS進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，中藥大劑量組與小劑量組ox-LDL、sCD40L含量均不同程度下降，中藥大劑量組與辛伐他汀組ox-LDL、sCD40L降低幅度相當(dāng)；頸總動(dòng)脈HE染色顯示，中藥大劑量組病變程度顯著減輕，內(nèi)膜較光滑，彈力纖維板間隙增大不明顯，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，未見明顯泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞；中藥大劑量組與小劑量組斑塊中ICAM-1、TNF-α表達(dá)顯著減少；通過熒光定量PCR法檢測AS斑塊內(nèi)CD40mRNA及IL-1βmRNA表達(dá)顯示，中藥大劑量組大鼠斑塊內(nèi)CD40mRNA與IL-1βmRNA表達(dá)顯著降低，CD40mRNA降低與辛伐他汀組相當(dāng)，IL-1βmRNA降低優(yōu)于辛伐他汀組。綜上所述，參紅通絡(luò)方具有較好抑制炎癥因子、抗AS、穩(wěn)定易損斑塊作用，該作用可能通過干預(yù)CD40/CD40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。