外源鈣離子對NaCl脅迫下油茶花粉萌發(fā)的影響

盧夢琪，周俊琴，劉懿瑤，楊 進(jìn)，譚曉風(fēng)

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

我國鹽漬化土壤面積達(dá)250 萬hm2，主要分布在東北、華北、西北及華東地區(qū)的19 個省區(qū)，且面積有擴(kuò)大趨勢[1]。鹽土中主要以NaCl、Na2SO4等可溶性鹽類為主，土壤肥力差，結(jié)構(gòu)透氣性差，土壤中過量的鹽離子可直接對植物造成毒害作用，對作物的生長產(chǎn)生脅迫，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。鹽脅迫主要通過滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫等方式對植物造成傷害，影響植物的生長。滲透脅迫會降低土壤中的滲透壓，從而使植物難以吸收水分，發(fā)生生理干旱，阻礙植物生長發(fā)育。離子脅迫會使鹽離子在植株體內(nèi)累積，破壞其正常生理代謝，從而抑制生長[2]。因此，改良和利用鹽漬化土壤，恢復(fù)和提高其生產(chǎn)力是一項艱巨的任務(wù)。而關(guān)于鹽脅迫對植物生長的影響已研究得很廣泛和深入。例如，鹽脅迫抑制文冠果幼苗的苗高生長量、地徑生長量、地上生物量和地下生物量的增長，且隨著NaCl 濃度的提高，抑制效果越明顯[3]。低濃度的NaCl對具有一定耐鹽性的‘吉美’海棠的生長不造成明顯影響，而高濃度的NaCl 會對其生長和生理活動造成脅迫作用，且脅迫程度隨脅迫時間的延長而增加[4]。外源噴施MT 或者Ca2+可顯著降低甜瓜根系和葉片中的Na+和Cl-含量，增強(qiáng)其對鹽脅迫的適應(yīng)性[5]。在百合、紫荊、含笑和水稻等物種中，NaCl 對它們的花粉萌發(fā)和花粉管生長均有抑制作用，而Ca2+能夠緩解NaCl對百合和水稻花粉萌發(fā)的抑制作用[6-9]，這間接說明了Ca2+參與了植物對鹽脅迫等非生物脅迫的適應(yīng)過程[10]。

油茶Camellia oleiferaAbel.是山茶屬Camellia的常綠灌木或小喬木，耐貧瘠，抗性較強(qiáng)，主要在我國南方地區(qū)種植，是世界四大木本油料樹種之一[11]。油茶種子榨出的油被稱為茶油，是一種營養(yǎng)價值極高的可食用油，耐儲藏，極易被人體吸收，且富含油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸以及角鯊烯、茶多酚和生育酚等多種活性物質(zhì)[12-13]。2016年，油茶被正式列入全國大宗油料作物范疇，受到政府高度重視。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)不僅有利于帶動地方經(jīng)濟(jì)，助推精準(zhǔn)扶貧，而且能提高食用植物油的供給，對維護(hù)國家油糧安全有十分重要的作用。目前，油茶的種植范圍逐漸向北擴(kuò)大，現(xiàn)已在湖北省、安徽省以及我國油茶北部邊緣產(chǎn)區(qū)河南省大力發(fā)展。為了更科學(xué)合理地擴(kuò)大油茶栽培面積，選育出適應(yīng)各種逆境脅迫環(huán)境的油茶品種，提高油茶產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價值，我國科研工作者已開展了油茶抗寒性[14]、耐旱性[15]、耐低溫、耐高溫[16]等方面的研究，但未見鹽脅迫對其生長尤其是花粉萌發(fā)的影響等方面的報道。鑒于此，本研究以油茶‘華碩’花粉為材料，探究了不同濃度NaCl 對油茶花粉生活力、花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響，以及Ca2+在NaCl 脅迫中所起到的作用，旨在探索給鹽漬化地區(qū)引種油茶的可能性，進(jìn)而指導(dǎo)生產(chǎn)實踐，為油茶的引種和栽培提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 花粉的采集和處理

2019年11月，在晴天上午11:00，采集國家審定的油茶主栽品種‘華碩’盛花期露白的花苞，油茶實驗基地位于湖南長沙望城縣。將花苞帶回實驗室，用鑷子將花藥用輕輕捋下，攤開于室溫下干燥，使花藥充分開裂，散出花粉，用1.5 mL無菌離心管分裝并存于-80℃冰箱。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 NaCl 濃度梯度與Ca2+濃度梯度設(shè)計

參考王湘南等[17]的方法，配制油茶花粉基本培養(yǎng)基：10%蔗糖+0.015%硼酸（pH=6.5～7.0），將此設(shè)為對照組（CK）。在基本培養(yǎng)基和花粉處理液（無菌水）中分別添加不同量的1 M NaCl母液，使其終濃度為0、1、5、10、20、30、50、80、100 和200 mM。兩種培養(yǎng)基分別用于花粉的萌發(fā)和花粉活力檢測。

通過不同濃度NaCl 對油茶花粉萌發(fā)影響的實驗，確定對花粉有明顯抑制作用時的NaCl 濃度。以此NaCl 濃度為基礎(chǔ)，同時在基本培養(yǎng)基和花粉處理液（無菌水）中添加不同量的1 M Ca2+母液，使Ca2+終濃度為0、1、2、3、6、12、20 和25 mM，用于花粉的萌發(fā)和花粉生活力的檢測，來研究Ca2+在NaCl 脅迫條件下對油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。

1.2.2 花粉萌發(fā)實驗

將花粉從-80℃冰箱取出，室溫解凍2 h。在用毛筆蘸取花粉，均勻撒在相應(yīng)培養(yǎng)基中，在25℃恒溫?fù)u床中輕輕晃動培養(yǎng)4 h。在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況和花粉管形態(tài)，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率和花粉管長度。每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)觀察5 個視野，每個視野中的花粉不少于50 粒。以花粉管長度大于花粉直徑作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計萌發(fā)率。每一個重復(fù)隨機(jī)測定至少50 個花粉管長度，統(tǒng)計花粉管長度平均數(shù)。

1.2.3 花粉生活力檢測

花粉生活力采用噻唑藍(lán)（MTT）染色法檢測。參考Rodriguez-Riano 和Dafni[18]的方法，配制染色液：1% MTT+5%蔗糖，4℃避光保存。取200 μL花粉處理液于1.5 mL 無菌離心管中，用牙簽蘸取解凍后的花粉，放入其中。滴加2～3 滴MTT 染料，37℃避光孵育30 min?；靹蚝?，取50 μL 于凹面載玻片上進(jìn)行顯微觀察，統(tǒng)計有生活力花粉所占的比例。每個處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)觀察3個視野。所用花粉與萌發(fā)實驗所用花粉為同一批。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)用Excel 軟件匯總，使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（鄧肯分析），使用Origin 2017 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 對油茶花粉活力的影響

通過MTT 染色法檢測不同濃度NaCl 處理的油茶花粉生活力，結(jié)果表明，經(jīng)1% MTT 染色后，各濃度NaCl 處理的花粉顏色均出現(xiàn)了明顯變化，生活力高的花粉呈深藍(lán)紫色、生活力較低的花粉呈淺紅色或淺紫色、無生活力的花粉呈黃色或未著色，區(qū)分比較明顯，容易分辨（圖1B）?；ǚ凵盍Φ慕y(tǒng)計結(jié)果表明：NaCl 濃度為0 mM（CK）時，花粉生活力為72.48%，隨著NaCl 濃度的提高，花粉生活力逐漸下降。在NaCl 濃度為20 mM時，花粉生活力顯著下降，只有36.22%，是CK的49.97%（圖1A），當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到200 mM 時，花粉生活力只有26.37%，是CK 的36.38%。

圖1 NaCl 處理下的油茶花粉生活力Fig.1 The pollen viability of Camellia oleifera under NaCl treatment

2.2 NaCl 對油茶花粉萌發(fā)的影響

用不同濃度的NaCl 處理花粉，對其萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計，在顯著性水平為0.05 時，分析各處理組萌發(fā)率之間的差異，且用不同字母表示其差異性，具體結(jié)果如圖2所示。當(dāng)NaCl 濃度為0 mM（CK）時，花粉萌發(fā)率為74.01%（圖2A—B），隨著NaCl 濃度的增加，萌發(fā)率逐漸下降。當(dāng)NaCl 濃度達(dá)到80 mM 以上時，花粉萌發(fā)率低于10%，200 mM NaCl 處理下，花粉萌發(fā)率為0。說明NaCl 對油茶花粉的萌發(fā)有抑制作用，且抑制效果隨著NaCl 濃度的提高而增強(qiáng)，而高濃度NaCl 可完全抑制花粉萌發(fā)。當(dāng)NaCl 濃度為20 mM 時，花粉萌發(fā)率顯著降低，為42.84%，是CK 的57.33%（圖2A、C），所以，將用20 mM NaCl 對花粉萌發(fā)和花粉管生長進(jìn)行脅迫，研究外源鈣離子在其中的作用。

圖2 NaCl 處理下的油茶花粉萌發(fā)率Fig.2 The pollen germination rate of Camellia oleifera under NaCl treatment

觀察花粉管的形態(tài)時發(fā)現(xiàn)，在NaCl 脅迫處理下，部分花粉管表現(xiàn)出了頂端膨大的形態(tài)，影響了花粉管的生長（圖3B）。對花粉管長度進(jìn)行統(tǒng)計和顯著性水平為0.05 的差異性分析，發(fā)現(xiàn)隨著NaCl 濃度的提高，花粉管長度逐漸變短。當(dāng)NaCl 濃度為0 mM（CK）時，花粉管長度為32.29 μm，當(dāng)NaCl 濃度提高到1 mM 時，花粉管長度減短到25.74 μm，出現(xiàn)了明顯的抑制作用。當(dāng)NaCl 濃度提高到20 和30 mM 時，花粉管長度分別減短到23.75 μm 和17.36 μm，分別是CK 的73.54%和53.75%。當(dāng)NaCl 濃度大于80 μm 時，花粉管長度小于6 μm（圖3A、C），說明NaCl抑制油茶花粉管的伸長，且高濃度NaCl 可完全抑制花粉管的生長。

圖3 NaCl 處理下的花粉管生長情況Fig.3 The pollen tube growth of Camellia oleifera under NaCl treatment

2.3 Ca2+在NaCl 抑制油茶花粉生活力中的作用

在20 mM NaCl 的脅迫下，不同濃度的外源Ca2+處理油茶花粉，經(jīng)1% MTT 染色，統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，隨著Ca2+濃度的提高，花粉生活力呈緩慢下降趨勢。當(dāng)Ca2+濃度為0 mM 時，花粉生活力為45%。當(dāng)Ca2+濃度為1 mM 時，花粉生活力明顯下降，為36.98%，是0 mM Ca2+處理的82.18%。當(dāng)Ca2+濃度高于3mM 時，生活力一直維持在28.59%左右，是0 mM Ca2+處理的63.53%（圖4）。說明在20 mM NaCl 的脅迫下，外源Ca2+對油茶花粉生活力有一定的抑制作用，當(dāng)Ca2+濃度高于3 mM 時，抑制效果最為明顯。

圖4 Ca2+對NaCl 脅迫下的油茶花粉生活力的影響Fig.4 The effects of Ca2+ on the pollen vitality of Camellia oleifera under NaCl stress

2.4 Ca2+在NaCl 抑制油茶花粉萌發(fā)中的作用

在20 mM NaCl 的脅迫下，研究不同濃度外源Ca2+對油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。統(tǒng)計和分析花粉萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)，在Ca2+濃度為1 mM 時，花粉萌發(fā)率稍有下降，為41.94%，但與0 mM Ca2+處理下無明顯差別。而當(dāng)Ca2+濃度提高到2 mM 時，花粉萌發(fā)率顯著提高，為60.5%，是0 mM Ca2+處理下的130.92%，之后花粉萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率下降且維持在29%左右（圖5A）。對花粉管長度進(jìn)行測量和分析發(fā)現(xiàn)，隨著Ca2+濃度的增加，花粉管長度緩慢增長。當(dāng)Ca2+濃度為1 mM 時，花粉管長度為23.06 μm，與0 mM Ca2+處理無明顯差別，當(dāng)Ca2+濃度提高到2 mM 時，花粉管長度有明顯提高，為28.4 μm。當(dāng)Ca2+濃度在3～20 mM 時，花粉管的長度稍有增長，但與2 mM 時的無明顯差異。而當(dāng)Ca2+濃度提高到25 mM 時，花粉管是最長的，為35.05 μm，明顯高于CK 和0 mM Ca2+處理（圖5A—B）。

觀察花粉管形態(tài)發(fā)現(xiàn)，花粉管頂端有異?，F(xiàn)象。當(dāng)Ca2+濃度為1～2 mM 時，有少量花粉管存在頂端破裂現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象主要出現(xiàn)在花粉管剛剛長出來時，此時花粉管長度短于花粉直徑，并未達(dá)到萌發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)Ca2+濃度為3～25 mM時，花粉管頂端破裂現(xiàn)象更加嚴(yán)重，在不同長度的花粉管中均存在，但主要存在于剛剛萌發(fā)出來的花粉管或者較短的花粉管中（圖5C）。

圖5 Ca2+對NaCl 脅迫下的油茶花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Fig.5 The effects of Ca2+ on the pollen germination and pollen tube growth of Camellia oleifera under NaCl stress

由此可知，在20 mM NaCl 脅迫下，2 mM Ca2+能緩解這種脅迫效應(yīng)，促進(jìn)油茶花粉萌發(fā)和花粉管伸長。濃度高于2 mM 的Ca2+對油茶花粉管伸長也有明顯促進(jìn)作用，但高濃度Ca2+（≥3 mM）能使部分油茶花粉管頂端破裂。

3 結(jié)論與討論

植物的花粉活性、花粉萌發(fā)和花粉管生長直接關(guān)系到植物生殖生長中的授粉受精環(huán)節(jié)，影響種子的形成和產(chǎn)量。本試驗是通過MTT 染色法來判斷油茶花粉生活力的，其原理是MTT 被線粒體內(nèi)膜上的琥珀酸脫氫酶還原，形成一種非水溶性藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，沉積在細(xì)胞中[19]。銀腺楊有活性的花粉被MTT 染成紅色[20]，香蕉有活性的花粉被MTT 染成紫色[21]。在本研究中，油茶有活性的花粉被MTT 染成深藍(lán)紫色、淺紅色或者淺紫色，說明不同植物花粉的MTT 染色效果不一樣。NaCl 對油茶花粉生活力有抑制作用，在NaCl 濃度在0～20 mM 時，花粉生活力與花粉萌發(fā)率比較接近，而當(dāng)NaCl 濃度高于20 mM 時，花粉生活力高于萌發(fā)率，說明當(dāng)NaCl 濃度高于20 mM 時，部分有萌發(fā)潛力的花粉受到了更明顯地抑制而沒有萌發(fā)。外源Ca2+不能提高反而抑制了NaCl 脅迫條件下的花粉生活力，這可能是NaCl 對花粉生活力的抑制作用是不可逆的，并且外源Ca2+可能對花粉產(chǎn)生了毒害作用。另外，在NaCl 脅迫條件下，除了2 mM Ca2+處理下的花粉生活力低于萌發(fā)率之外，其他Ca2+濃度下的花粉生活力與萌發(fā)率相差不大。以上可說明油茶與香蕉[21]、杜鵑紅山茶[22]等植物一樣，也適合用MTT 染色法判斷花粉生活力。

在本研究中，油茶花粉和花粉管對NaCl 比較敏感，低濃度的NaCl 顯著抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長，且抑制效果隨NaCl 濃度的提高而增強(qiáng)，這與紫荊[7]、含笑[8]等樹種一致，但梔子[23]、毛杜鵑[24]等樹種的花粉對NaCl 的響應(yīng)不一樣，呈現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的規(guī)律，說明不同樹種的花粉對NaCl 的敏感性不一樣。而一定濃度的外源Ca2+可以緩解NaCl 對油茶花粉的脅迫作用，促進(jìn)NaCl 脅迫條件下花粉萌發(fā)和花粉管生長，與百合[6]、水稻[9]等樹種一致，這說明Ca2+可能參與了油茶花粉對NaCl 環(huán)境的適應(yīng)過程，也暗示著NaCl 對油茶花粉的抑制作用可能主要是一種離子毒害。在NaCl 脅迫條件下，通過質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)腃a2+能被Na+取代，導(dǎo)致質(zhì)膜的通透性和選擇透過性發(fā)生改變，從而阻礙正常的生理生化代謝過程[25]，而外源添加Ca2+后，可能補(bǔ)充了植物對Ca2+的一部分需求，從而起到了緩解抑制的效果。

花粉的萌發(fā)和花粉管的生長都離不開Ca2+。水稻成熟花粉中鈣顆粒主要沉積在花粉外壁，而胞內(nèi)基本無鈣顆粒沉積，花柱的乳突細(xì)胞表面和薄壁細(xì)胞中也存在鈣顆粒[26-27]?；ǚ鬯虾?，大量的鈣顆粒聚集到萌發(fā)孔啟動花粉的萌發(fā)，花柱道里會形成Ca2+梯度，引導(dǎo)花粉的定向生長[28-29]。鹽脅迫會破壞細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，Na+、Cl-大量內(nèi)流，K+、Ca2+等離子含量發(fā)生變化[30]。因此，可以猜測當(dāng)花粉培養(yǎng)液中存在大量的Na+、Cl-時，Na+、Cl-會內(nèi)流進(jìn)入花粉和花粉管細(xì)胞，打破原有的離子平衡狀態(tài)，影響花粉和花粉管胞內(nèi)的Ca2+分布，造成Ca2+無法正常形式其功能，最終導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管生長受阻。在外源添加Ca2+后，調(diào)節(jié)了離子平衡，促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長，但Ca2+只有在合適濃度范圍內(nèi)才有促進(jìn)作用。在本研究中，2 mM Ca2+顯著促進(jìn)NaCl 脅迫條件下花粉的萌發(fā)，可能是適量的Ca2+聚集到了萌發(fā)孔，促進(jìn)了花粉萌發(fā)，而高濃度（≥3 mM）的Ca2+會使剛萌發(fā)出的花粉管頂端破裂，對花粉萌發(fā)有抑制作用，可能是高濃度的Ca2+造成了細(xì)胞Ca2+中毒或者細(xì)胞膨壓過大。這與百合[5]等結(jié)果一致。然而，NaCl 在油茶花粉和花粉管內(nèi)如何起脅迫作用的，Ca2+是如何提高油茶花粉和花粉管對NaCl的適應(yīng)能力的，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，NaCl 會對油茶花粉生活力、花粉萌發(fā)和花粉管生長造成脅迫，且脅迫程度隨著NaCl 濃度的提高而增加。因此，在油茶的栽培和管理過程中，應(yīng)對油茶進(jìn)行合理的鹽分管理措施，應(yīng)避免在連續(xù)干旱時不澆水而使土壤積鹽以及將油茶引種到鹽漬化地區(qū)，使油茶處在NaCl 脅迫環(huán)境中。一定濃度的Ca2+能有效促進(jìn)NaCl 脅迫下油茶花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長，可為今后研究提高油茶的耐鹽性提供參考資料。