香辛料對(duì)低鈉鹽肌原纖維蛋白氧化體系凝膠特性的影響

魏娜，張建華，夏楊毅,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

肌肉蛋白中50%～60%為鹽溶性的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)，通常2%～3%的NaCl能夠溶解MP并在熱誘導(dǎo)的作用下形成凝膠，對(duì)肉糜制品的品質(zhì)有著至關(guān)重要的影響。NaCl是形成熱誘導(dǎo)凝膠的關(guān)鍵因素，但過(guò)量鈉攝入會(huì)損害人體健康，因此既能保證肉品凝膠特性又能降低鈉含量的食鹽替代研究逐漸成為熱點(diǎn)，其中以氨基酸與KCl的復(fù)合物部分替代效果較好。GUO等[1]研究發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸和L-組氨酸能夠引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化并增加肌球蛋白的溶解度，張建華等[2]研究發(fā)現(xiàn)隨添加比例的升高，HL-低鈉鹽的MP凝膠強(qiáng)度、保水性和彈性模量顯著升高。但馬志方[3]研究發(fā)現(xiàn)在成熟后期，低鈉鹽組金華火腿的蛋白降解指數(shù)顯著高于食鹽組，表明食鹽替代物可能會(huì)加速蛋白氧化，最終導(dǎo)致肉制品的保水性、嫩度、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等品質(zhì)以及貯藏特性的改變[4]。

香辛料是一種天然抗氧化劑，目前大量研究表明香辛料有較好的抗氧化特性，CHEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)0.03%的丁香提取物能顯著抑制Fenton氧化體系的蛋白氧化。JONGBERG等[6]研究表明高濃度的綠茶提取物能阻止二硫鍵的生成，破壞肉糜凝膠特性。其抗氧化作用主要通過(guò)清除自由基實(shí)現(xiàn)，作用機(jī)理主要有：(1)直接與自由基反應(yīng)；(2)間接消耗容易生成自由基的物質(zhì)；(3)抑制與產(chǎn)生自由基相關(guān)的酶的活性[7]。目前關(guān)于香辛料改善低鈉鹽MP氧化體系凝膠特性的研究未有報(bào)道，因此本試驗(yàn)以MP為原料，添加2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))低鈉鹽加速氧化體系作對(duì)照組，探討添加量為0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的4種香辛料(丁香、花椒、迷迭香和肉豆蔻)對(duì)其凝膠特性的影響，進(jìn)而初步探索香辛料對(duì)低鈉鹽MP氧化體系凝膠的影響機(jī)理，為香辛料在低鈉鹽MP凝膠中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝肉，浙江省紹興市天天肉食品有限公司；香辛料提取物(丁香、花椒、迷迭香、肉豆蔻)，南京草本源生物有限公司；HL-低鈉鹽(氯化鉀45.2%，氯化鈉42.8%，葡萄糖酸鈉3.5%，L-賴氨酸 7.0%，L-組氨酸 1.5%)，自配。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16型醫(yī)用冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿器，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SYNERGYH1MG型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)基因公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司；MCR302模塊化旋轉(zhuǎn)與界面流變儀，德國(guó)Anton公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

選取120 d齡的白條鵝，清洗干凈，剔除筋膜、脂肪及結(jié)締組織后切碎，于-20 ℃的冰箱保存待用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考張建華等[2]的方法，4 ℃保存，48 h內(nèi)用完。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，雙縮脈法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定

采用Folin-酚法[8]，配制100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL比色管中。加入0.2 mL Folin-酚試劑混勻，加入0.5 mL 飽和碳酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL。27 ℃水浴1 h后，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值。繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：y=0.006 3x+0.044 8，R2=0.996 7。

準(zhǔn)確稱取0.1 g香辛料提取物定容至25 mL，吸取0.5 mL提取溶液于10 mL比色管中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定樣品的吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算多酚含量，單位為 mg GAE/g。

1.3.4 香辛料處理低鈉鹽氧化肌原纖維蛋白

參照TAKAI等[9]的方法略作修改，將上述MP加入到混合溶液中(0.5 mol/L KCl，10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L 抗壞血酸，5 mmol/L H2O2溶液，pH=6.0)，并以4 500 r/min的速度勻漿30 s后調(diào)節(jié)濃度至15 mg/mL。將MP分為5組，以未添加香辛料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的低鈉鹽為對(duì)照，在2.5%低鈉鹽的基礎(chǔ)上添加0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的4種香辛料為處理組，分別為0.03%丁香、0.03%花椒、0.03%迷迭香、0.03%肉豆蔻。在4 ℃條件下分別氧化24、48和72 h后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.5 肌原纖維蛋白凝膠的制備

參照付淵[10]的方法，將上述MP溶液置于水浴鍋中，以2 ℃/min使其溫度從25 ℃逐漸升高至40 ℃，恒溫處理30 min，再加熱至80 ℃，保溫30 min，然后將溶液取出冷卻，于4 ℃冰箱中冷藏過(guò)夜。進(jìn)行測(cè)定之前將MP凝膠在室溫下放置30 min。

1.3.6 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參照徐幸蓮[11]的方法略作修改。采用TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，參數(shù)設(shè)置：探頭型號(hào)P/0.5，測(cè)前速度2 mm/s，測(cè)試速度1.0 mm/s，測(cè)后速度1.0 mm/s，觸發(fā)力5 g，變性率為40%。

1.3.7 凝膠保水性的測(cè)定

參照MA[12]的方法略作改動(dòng)。將MP凝膠在4 ℃、3 000 r/min離心10 min,去除水分并稱重。保水性表示為離心前后凝膠質(zhì)量的比值。

1.3.8 凝膠蒸煮損失率的測(cè)定

蒸煮前離心管的質(zhì)量記為M(g)、離心管和MP的質(zhì)量記為M1(g)，蒸煮后去除水分的離心管和MP的質(zhì)量記為M2(g)，MP凝膠的蒸煮損失率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.9 凝膠化學(xué)作用力的測(cè)定

將上述5種溶液混勻后在4 ℃ 下靜置120 min，10 000×g離心10 min后采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。離子鍵含量為B溶液與A溶液蛋白質(zhì)含量差值；氫鍵含量為C溶液與B溶液蛋白質(zhì)含量差值；疏水相互作用含量為D溶液與C溶液蛋白質(zhì)含量差值；二硫鍵含量為E溶液與D溶液蛋白質(zhì)含量差值。

1.3.10 流變特性的測(cè)定

將MP溶解在0.5 mol/L氯化鉀氧化體系中，配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL的MP溶液。參數(shù)設(shè)置為：夾具60 mm，上下板間隙1 mm。升溫程序?yàn)?5～80 ℃，升溫速率為1 ℃/min，80 ℃保持10 min，振蕩頻率為1 Hz，應(yīng)力振幅為0.01；動(dòng)態(tài)頻率程序?yàn)?～16 Hz，測(cè)試溫度為 25 ℃，應(yīng)變?yōu)?1%。測(cè)定流變的儲(chǔ)能模量(G′)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，SPSS 19.0進(jìn)行方差分析(Duncan法)和顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，采用Origin 2019b進(jìn)行圖像處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 香辛料提取物的多酚含量

由圖1可知，香辛料提取物的多酚含量差異顯著(P<0.05)，且含量遵循以下順序：迷迭香>丁香>肉豆蔻>花椒，表明不同香辛料提取物的抗氧化差異可能與多酚含量有關(guān)。

圖1 香辛料提取物多酚含量Fig.1 Polyphenol content in the spices 注：a～d表示不同香辛料中多酚含量差異顯著

2.2 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度的影響

由圖2可知，添加香辛料的低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度在氧化周期內(nèi)顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致，這是因?yàn)槭杷鶊F(tuán)隨氧化加劇而大量暴露，導(dǎo)致蛋白無(wú)法與水形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)從而降低低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度[14]。同一氧化時(shí)間，添加迷迭香的低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，添加丁香和肉豆蔻的低鈉鹽MP氧化48 h后、花椒低鈉鹽MP氧化72 h后的凝膠強(qiáng)度也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；說(shuō)明香辛料的添加有利于低鈉鹽MP凝膠的形成，且添加迷迭香改善低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度的效果最佳。原因在于香辛料提取物具有抗氧化成分，能抑制蛋白氧化，使凝膠結(jié)構(gòu)的破壞程度降低，結(jié)構(gòu)緊湊；也有可能是香辛料提取物添加到MP后，在加熱時(shí)共價(jià)交聯(lián)形成混合凝膠，使凝膠更加致密，進(jìn)而增加凝膠強(qiáng)度[15]。迷迭香提取物多酚含量更高，抗氧化活性更高，對(duì)蛋白氧化的抑制作用更明顯。

圖2 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of spices on strength of low sodium salt myofibrillar protein gel 注：A～C表示不同氧化周期之間差異顯著；a～g表示在 同一周期內(nèi)不同處理組之間差異顯著(下同)

2.3 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠保水性的影響

由圖3可知，添加香辛料的低鈉鹽MP保水性在氧化周期內(nèi)顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致，說(shuō)明氧化應(yīng)激會(huì)損害MP的膠凝能力[16]；香辛料添加組在同一氧化時(shí)間的保水性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且添加迷迭香的低鈉鹽MP凝膠保水性顯著高于其他香辛料添加組(P<0.05)，花椒和肉豆蔻的低鈉鹽MP凝膠保水性最低、且差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明香辛料的添加能改善低鈉鹽MP凝膠保水性，且添加迷迭香后提高低鈉鹽MP凝膠保水性的效果最佳。

圖3 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠保水性的影響Fig.3 Effect of spices on water retention of low sodium salt myofibrillar protein gel

保水性與多汁性和質(zhì)地有關(guān)，是肉制品的重要品質(zhì)特征[17]。凝膠保水性取決于化學(xué)作用力，例如交聯(lián)、疏水相互作用和氫鍵等，因此蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)和蛋白間的相互作用均能引起MP凝膠保水性的變化[18]。香辛料作為一種天然抗氧化劑，含有多酚黃酮等抗氧化物質(zhì)。張慧蕓等[19]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)添加酚類物質(zhì)能夠提高蛋白交聯(lián)能力，增強(qiáng)MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從而使保水效果更好，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這是因?yàn)槎喾游镔|(zhì)的羥基能與蛋白質(zhì)的二硫鍵和非二硫鍵相互作用使蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[20]，從而使MP的凝膠保水性增強(qiáng)。

2.4 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠蒸煮損失率的影響

由圖4可知，添加香辛料的低鈉鹽MP蒸煮損失率在氧化周期內(nèi)顯著升高(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致；同一氧化時(shí)間，添加迷迭香的低鈉鹽MP凝膠蒸煮損失率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，添加丁香和肉豆蔻的低鈉鹽MP氧化48 h后、花椒低鈉鹽MP氧化72 h后的凝膠蒸煮損失率也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；說(shuō)明香辛料的添加能降低低鈉鹽MP凝膠蒸煮損失率，且添加迷迭香后低鈉鹽MP凝膠蒸煮損失率降低的程度最高。曹云剛等[21]研究發(fā)現(xiàn)MP溶解度隨氧化強(qiáng)度的增大而減小，蛋白溶解度的降低能增大MP凝膠間隙，使得蒸煮損失率大大提高，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。香辛料的添加能夠減輕蛋白氧化程度，從而提高蛋白溶解度，花椒提取物的多酚含量顯著低于迷迭香提取物，因而對(duì)蛋白氧化的抑制程度低。MONTERO等[22]研究表明0.03%迷迭香提取物抑制蛋白氧化的效果比0.03%花椒提取物更顯著，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠蒸煮損失率的影響Fig.4 Effect of spices on cooking loss of low sodium salt myofibrillar protein gel

2.5 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠化學(xué)作用力的影響

由圖5可知，MP凝膠的化學(xué)作用力由大到小依次為：疏水相互作用>二硫鍵>氫鍵>離子鍵，因此疏水相互作用、二硫鍵和氫鍵是維持低鈉鹽MP凝膠的主要作用力，離子鍵相互作用較小。添加香辛料的低鈉鹽MP凝膠離子鍵、氫鍵和二硫鍵含量在氧化周期內(nèi)顯著降低(P<0.05)、疏水相互作用含量顯著升高(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致；同一氧化時(shí)間，香辛料添加組的低鈉鹽MP凝膠離子鍵、氫鍵和二硫鍵含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，疏水相互作用含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；說(shuō)明香辛料能改善低鈉鹽MP凝膠的化學(xué)作用力，且不同種類的香辛料對(duì)其有顯著差異的影響(P<0.05)，離子鍵、氫鍵和二硫鍵含量遵循以下順序：迷迭香>丁香>肉豆蔻>花椒添加組，疏水相互作用含量如下：迷迭香<丁香<肉豆蔻<花椒添加組。

a-離子鍵；b-氫鍵；c-二硫鍵；d-疏水相互作用圖5 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.5 Effect of spices on the chemical action of low sodium salt myofibrillar protein gel

蛋白結(jié)構(gòu)與化學(xué)作用力緊密關(guān)聯(lián)，熱誘導(dǎo)能夠平衡蛋白分子間的化學(xué)作用力從而形成穩(wěn)定的MP凝膠結(jié)構(gòu)[23]。但蛋白氧化能使氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露、化學(xué)鍵破壞以及多肽鏈斷裂等從而引發(fā)一系列反應(yīng)[24]，疏水相互作用含量的增加可能是由于疏水基團(tuán)的大量暴露并聚集[25]，離子鍵的減少可能是氧化促進(jìn)了離子鍵的斷裂，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)使得與氫鍵相關(guān)的α-螺旋含量下降可能導(dǎo)致氫鍵含量的減少[26]，巰基暴露后可能發(fā)生不可逆氧化反應(yīng)導(dǎo)致二硫鍵含量的減少[27]。香辛料的加入使得化學(xué)作用力較為平衡，從而提高M(jìn)P凝膠形成能力，這是因?yàn)橄阈亮虾卸喾宇愇镔|(zhì)，能在一定程度上抑制蛋白氧化，從而減少氨基酸基團(tuán)如疏水基團(tuán)的暴露以及離子鍵的斷裂；植物多酚還能以氫鍵和疏水相互作用等方式與蛋白相互作用，進(jìn)而影響蛋白性質(zhì)[28]。

2.6 香辛料對(duì)低鈉鹽MP溫度掃描彈性模量的影響

儲(chǔ)能模量(G′)又稱彈性模量，反映樣品的彈性。蛋白凝膠的G′越大，彈性越好，越有利于形成MP凝膠[29]。由圖6可知，添加香辛料的低鈉鹽MP凝膠G′在氧化周期內(nèi)顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致，說(shuō)明氧化能降低凝膠形成能力；同一氧化時(shí)間，添加香辛料的G′高于對(duì)照組，說(shuō)明香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠形成有促進(jìn)作用。這可能是由于香辛料提取物與MP相互作用后結(jié)合位點(diǎn)增加，增大了蛋白質(zhì)與酚的交聯(lián)密度，生成大分子聚合物，從而導(dǎo)致G′增大[30-32]。賈娜等[33]研究發(fā)現(xiàn)在一定NaCl濃度下，添加迷迭香提取物可以提高M(jìn)P凝膠G′，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。40～50 ℃時(shí)，香辛料添加組的G′與對(duì)照組差異不顯著，這可能是因?yàn)榧訜岢跗谙阈亮系募尤雽?dǎo)致MP頭部聚集減少且尾部聚集增加，蛋白分子運(yùn)動(dòng)加劇因而流動(dòng)性增加。不同香辛料對(duì)流變的影響不同，由高到低依次是：迷迭香>丁香>肉豆蔻>花椒添加組，這與低鈉鹽MP凝膠強(qiáng)度和保水性的變化趨勢(shì)一致。

a-氧化24 h；b-氧化48 h；c-氧化72 h圖6 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠溫度掃描G′的影響Fig.6 Effect of spices on the intermittent elastic modulus of low sodium salt myofibrillar protein gel

2.7 香辛料對(duì)低鈉鹽MP頻率掃描彈性模量的影響

由圖7可知，添加香辛料的MP凝膠G′在氧化周期內(nèi)顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組變化一致，這與2.6結(jié)論相似,在0～2 Hz時(shí)急劇升高，2 Hz以后則幾乎保持不變；同一氧化時(shí)間，添加香辛料的MP凝膠G′顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且對(duì)MP凝膠的形變頻率幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明香辛料提取物的加入更有利于優(yōu)質(zhì)MP凝膠的形成，凝膠形成能力遵循以下順序：迷迭香>丁香>肉豆蔻>花椒添加組，表明不同抗氧化成分和含量對(duì)MP凝膠的影響不同。有研究[34]發(fā)現(xiàn)添加高濃度的迷迭香酸(1.25 mmol/L)會(huì)使MP凝膠的流變曲線趨于平緩因而不能形成凝膠，說(shuō)明香辛料提取物的添加需要在一定的濃度范圍內(nèi)。

a-氧化24 h；b-氧化48 h；c-氧化72 h圖7 香辛料對(duì)低鈉鹽MP凝膠頻率掃描G′的影響Fig.7 Effect of spices on the frequency elastic modulus of low sodium salt myofibrillar protein gel

3 結(jié)論

氧化周期(72 h)內(nèi)，添加4種香辛料的2.5%低鈉鹽MP凝膠特性顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組的變化一致；但香辛料能提高低鈉鹽MP的凝膠形成能力，使疏水相互作用含量降低，二硫鍵和氫鍵含量升高，維持MP凝膠穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高M(jìn)P凝膠強(qiáng)度、保水性和G′，降低蒸煮損失率，且4種香辛料的凝膠形成能力按照以下順序：迷迭香>丁香>肉豆蔻>花椒添加組。

香辛料能不同程度地抑制MP氧化，減少蛋白氧化程度，維持蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能特性，改善MP凝膠特性，從而有利于優(yōu)質(zhì)MP凝膠的形成，但香辛料抗氧化物質(zhì)及含量不同會(huì)對(duì)低鈉鹽MP凝膠產(chǎn)生不同的影響。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步研究香辛料對(duì)低鈉鹽蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，并探討香辛料在不同類型的低鈉鹽中對(duì)凝膠特性的影響。