基于綜合數據庫分析ASXL1基因突變對子宮內膜癌預后的影響及作用機制

范玥 韓馨樂 杜俊

子宮內膜癌（Endometrial carcinoma，EC）是女性第六大常見的惡性腫瘤。近年來，發(fā)病率持續(xù)上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅女性健康[1]。根據2015年中國癌癥數據分析顯示子宮內膜癌預計年發(fā)病率為60/10萬，死亡率約為20/10萬，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[2]。2013年，人類癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）根據不同突變方式和拷貝數將EC劃分為4種分子分型，即POLE（DNA聚合酶ε）突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型、低拷貝數型和高拷貝數型。該分子分型對預后判斷及精準治療有重要意義，但也存在局限性[3，4]。在腫瘤精準治療的背景下，探討基因突變的預后意義及作用機制，對靶向治療的靶點選擇具有重要參考意義。ASXL1（Additional sex combs like 1）基因首次于2009年在骨髓增生異常綜合征（MDS）中報道[5]，其位于染色體20q11，靠近DNMT3B基因[6]，由12個外顯子組成。根據既往研究，ASXL1基因突變在血液系統(tǒng)髓系腫瘤中是預后不良的生物學標志物[7]，包括骨髓增殖性腫瘤（MPN）、骨髓增生異常綜合征（MDS）、慢性粒單核細胞白血?。–MML）和急性髓系白血?。ˋML）等。然而，ASXL1在EC中的預后意義鮮有報道，其相關機制仍有待研究。本研究旨在通過多種腫瘤綜合數據庫，分析ASXL1基因突變在EC患者中的預后意義及可能的作用機制，為EC的精準治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源與方法基于GEPIA數據庫（http://gepia.cancerpku.cn/）分析ASXL1基因突變在EC患者中的預后意義及其與臨床分期的關系。同時，通過獲取在EC中與ASXL1有相似表達特征的前200個基因，對其信號通路相關性及蛋白質互作網絡做了進一步分析。

基于Kaplan-Meier plotter數據庫（https://kmplot.com/analysis/），匯總ASXL1基因突變在EC患者中的預后意義，包括總生存期（Overall survival，OS）與無復發(fā)生存期（Relapse-free survival，RFS）。通過將ASXL1基因突變截分為高低兩組，比較兩組的生存差異，并進一步計算危險比（Hazard ratio，HR）、95%置信區(qū)間（95%CI）以及P值。

基于FireBrowse網站（http://www.firebrowse.org/），分析ASXL1的基因表達、DNA甲基化、拷貝數變異和突變狀態(tài)。同時，基于人類蛋白質圖譜圖像分類數據庫（Human Protein Atlas），ASXL1的組織、器官分布情況得以呈現(xiàn)，也對ASXL1的亞細胞定位進行分析。

STRING數據庫（https://string-db.org/）作為在線檢索已知蛋白質互作關系的數據庫，可對直接或間接的蛋白質互作網絡進行功能分析?；赟TRING數據庫，納入50個表達量相對較高的相關因素，結合Cytoscape軟件，進行蛋白質互作網絡分析（Protein-protein interaction network，PPI）。納入分析的最小相關性分數為0.400。

UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu）是基于TCGA數據庫在線分析和挖掘的網站。分析ASXL1基因在不同種族、年齡、更年期狀態(tài)以及組織學亞型EC患者中的表達水平。

DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）是基于Annotation Tool，GoCharts，KeggCharts以及Domain Charts四個分析模塊實現(xiàn)對數據的注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)，從而實現(xiàn)基因組規(guī)模數據集的分析。通過其在線分析功能，對ASXL1基因突變密切相關的生物學過程以及富集的信號通路進行初步探究。

1.2 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0軟件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進行統(tǒng)計學分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用雙側t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EC患者中ASXL1基因突變狀態(tài)及分布差異GEPIA數據庫檢索結果顯示ASXL1基因在多種腫瘤組織中異常表達，其中在EC中表達降低，見圖1。UALCAN數據庫檢索結果顯示ASXL1基因在不同種族、年齡、更年期狀態(tài)以及組織學類型中的分布差異。與正常組相比，年齡21～40歲組和41～60歲組中ASXL1基因水平有所降低（P＜0.001），各種族人群比較顯示高加索人群中EC患者ASXL1基因水平低于正常人群（P＜0.001），其余人種無統(tǒng)計學差異。絕經前人群中EC患者ASXL1基因水平明顯低于正常對照組（P＜0.001）。根據不同組織學亞型進行分組，EC中ASXL1基因水平明顯降低，而漿液性癌與之相反（P＜0.001），見圖2。

圖1 不同腫瘤類型與正常對照組織中ASXL1基因的表達情況

圖2 ASXL1基因在不同年齡、組織學類型、更年期狀態(tài)以及種族間的分布差異

利用The Human Protein Atlas數據庫追蹤ASXL1基因的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因主要定位于細胞的核質和核仁。通過FireBrowse網站分析了538例EC患者的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)突變水平較高的基因主要包括PTEN、PIK3CA、ARID1A、PIK3R1、CTNNB1、TP53、KRAS等，其突變類型主要為無義突變和錯義突變。

2.2 ASXL1基因突變在EC預后中的意義通過Kaplan-Meier Plotter數據庫根據log-rank法及生存曲線比較，顯示升高的ASXL1 mRNA水平與縮短的OS及RFS相關（P＜0.001）。通過GEPIA數據庫檢索結果發(fā)現(xiàn)ASXL1突變在不同時期腫瘤中存在差異，處于疾病進展期（Ⅲ、Ⅳ期）的EC患者較疾病初期（Ⅰ、Ⅱ期）的患者有所升高，見圖3。

圖3 ASXL1基因表達水平與OS、RFS及腫瘤分期之間關系

2.3 EC患者中ASXL1基因的突變狀態(tài)及功能預測在GEPIA數據庫檢索，獲取TCGA及GTEx測序數據中前200位與ASXL1有相似表達特征的基因，并通過Pearson相關系數對這些基因進行排序。采用GO分析及KEGG分析對ASXL1突變相關基因進行功能富集分析及信號通路預測。通過DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），發(fā)現(xiàn)與ASXL1突變密切相關的生物學過程主要包括DNA轉錄、RNA處理、RNA剪接等；蛋白質結合、組蛋白結合、DNA結合、轉錄共激活因子活性、序列特異性DNA結合等分子功能的改變與ASXL1基因突變有關；而核質、驅動蛋白復合物等細胞組分的改變與ASXL1基因異常表達有關。通過KEGG分析，這些相關基因突變主要與mTOR信號通路調節(jié)相關。見圖4。

圖4 GO分析與ASXL1基因異常表達有關的生物學過程（左）、細胞組分（中）和分子功能（右）之間的關系

2.4 PPI及ASXL1基因的相關性分析選取前50位與ASXL1有相似表達情況的相關基因，通過STRING數據庫（https://string-db.org/）在線分析以及Cytoscape軟件的可視化繪圖，進行了PPI分析。表觀遺傳學相關改變與ASXL1存在相互作用關系，包括HDAC2、DNMT3A、CBX家族以及TET2，見圖5。另外，在GEPIA數據庫中，通過TCGA及GTEx的數據集對ASXL1突變存在密切關系的基因做相關性分析。ASXL1基因突變與PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3及TET2多個基因存在正相關，其中PTEN（r=0.55，P＜0.001）、PIK3CA（r=0.73，P＜0.001）、JAK2（r=0.66，P＜0.001）、STAT3（r=0.6，P＜0.001）以及TET2（r=0.63，P＜0.001），見圖6。

圖5 ASXL1與相似基因表達的蛋白質互作圖

圖6 TET2、PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3基因與ASXL1表達的相互關系

3 討論

本研究顯示ASXL1在EC中存在基因突變。通過GEPIA和Kaplan-Meier plotter數據庫的生存分析發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變是EC的不良預后因素，與OS和RFS均存在相關。雖然ASXL1基因突變在EC中的預后價值極少報道，但從公共數據庫的大樣本分析看，該基因的突變狀態(tài)確實對生存造成了威脅。作為腫瘤抑制基因，ASXL1的缺失也是結直腸腫瘤（Colorectal cancer，CRC）中的不良預后因子[8]。有學者在結直腸樣本（408例結直腸癌、46例正常結腸粘膜、48例腺瘤及92例癌性淋巴結）中發(fā)現(xiàn)，ASXL1的缺失造成5年生存率明顯低于正常組（78.7%±2.5% vs 100%，P=0.034）。并且，在結直腸正常組織→腺瘤→腺癌→癌性淋巴結轉移發(fā)展的過程中，ASXL1基因缺失的比例也逐漸增加[8]。這表明ASXL1作為抑癌基因的缺失狀態(tài)是腫瘤患者的不良預后因素，其可能與淋巴結轉移相關，使得疾病更具侵襲性。在我們的分析中，ASXL1突變不僅是預后不良因素，且在疾病晚期的患者中突變率顯著升高。這提示在EC中ASXL1突變同樣與疾病嚴重程度相關，是評判臨床預后的重要指標。

ASXL1基因突變如何發(fā)揮功能、影響預后，仍然缺乏可靠的基礎生物學研究。通過GO分析及KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)ASXL1參與的生物學過程主要包括DNA轉錄、RNA處理、RNA剪接等。結合相關性分析可以發(fā)現(xiàn)ASXL1與PTEN、PIK3CA、JAK2及STAT3基因存在相關性，ASXL1可能與PI3K/mTOR信號通路調節(jié)有關。眾所周知，PI3K/AKT/mTOR細胞內信號傳導途徑調節(jié)重要的細胞周期。PI3K（The phosphatidylinositol 3-kinase）是一類高度保守的酶家族，是胞內PI3K/AKT/mTOR信號軸的重要組成部分。PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞的生長、分化、凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用，其中信號轉導的很多成員分子，都是癌癥、免疫及控制血栓形成等過程中的關鍵藥物靶點[9]。PI3K激活磷酸化并激活AKT，使其定位在質膜上。AKT可以具有許多下游效應，如激活CREB，抑制p27，在細胞質中定位FOXO，激活PtdIns-3ps和激活mTOR可能會影響p70或4EBP1的轉錄。而腫瘤抑制基因PTEN能夠通過去磷酸化而使PIP3變?yōu)镻IP2，是該通路的負性調節(jié)因子[10]。在我們的分析中，ASXL1基因突變與PI3K/AKT/mTOR信號通路激活相關，且與PTEN基因突變存在正相關性，表明兩者可能發(fā)揮了協(xié)同致病的效應，共同導致疾病不良預后。

近年來，腫瘤的分子生物學檢測尤其是高通量測序，為精準治療創(chuàng)造了必要條件[11～13]?；谖覀儗C的腫瘤數據庫挖掘，以及生物信息學預測，干預PI3K/AKT/mTOR信號通路可能為患者治療帶來益處，尤其是對復發(fā)/轉移的EC患者。PI3K存在4種異構體，其信號協(xié)同有所差異，但最終與PTEN突變有重要關系，導致癌癥發(fā)生。PI3K下游存在兩條重要通路，其中FOXO主要與細胞分化有關，而mTORC主要與細胞增殖有關[14]。目前關于PI3K/AKT/mTOR信號通路的靶向干預治療報道較多，包括單獨或聯(lián)合靶向PI3K異構體以及靶向mTOR的藥物[15]。目前臨床可及的藥物包括PI3K抑制劑（Idelalisib、Infinity等）及mTOR抑制劑（雷帕霉素）。由于諸多惡性腫瘤中普遍存在PI3K/AKT/mTOR信號通路異常，包括實體瘤和血液惡性腫瘤[9]，故而以該通路為靶點研發(fā)腫瘤抑制劑也是研究熱點。但是，在其他實體腫瘤的研究中，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR單靶點抑制劑很難產生顯著、可持續(xù)的治療效應，而聯(lián)合用藥成為重要的研究方向[16～18]。目前，探索PI3Kα/mTOR雙靶點藥物如NVP-BEZ235、PI3Kα/δ/γ/PDK1雙靶點抑制劑等，均在實體腫瘤及血液病研究中存在巨大潛力，可能有可觀的臨床療效，具備應用前景[19]。

本研究通過腫瘤綜合數據庫，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變與EC患者不良預后有關，是重要的臨床預后參考指標，動態(tài)監(jiān)測基因突變狀態(tài)也有助于評估疾病進展狀態(tài)。同時，通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路調節(jié)有關，這表明靶向該通路的抑制劑可能成為潛在有效的治療方式，尤其是對于復發(fā)/進展的患者。不過本研究仍存在局限性：①本研究納入的人群為EC患者，來自于特定的國家和地區(qū)，可能缺乏種族特異性；②本研究通過公共數據庫生物信息學分析，缺乏嚴謹可靠的生物學驗證，其真實性仍然值得進一步研究；③基因測序的數據樣本量中等，在真實世界能否重現(xiàn)ASXL1突變的臨床預后意義，需要臨床隊列進行驗證。

綜上所述，我們通過多個腫瘤相關數據庫，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變是EC患者的不良預后因素，顯著影響OS及RFS，且與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。靶向該通路可能成為新的治療選擇，為復發(fā)/進展的EC患者帶來福音[20]，但需要嚴謹的生物學驗證以及前瞻性的臨床試驗證實。總之，探索ASXL1基因突變的預后意義及作用機制，可能成為未來EC精準治療的新研究方向。