基于綜合數(shù)據(jù)庫(kù)分析ASXL1基因突變對(duì)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的影響及作用機(jī)制

范玥 韓馨樂 杜俊

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial carcinoma，EC）是女性第六大常見的惡性腫瘤。近年來，發(fā)病率持續(xù)上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。根據(jù)2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)分析顯示子宮內(nèi)膜癌預(yù)計(jì)年發(fā)病率為60/10萬，死亡率約為20/10萬，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[2]。2013年，人類癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）根據(jù)不同突變方式和拷貝數(shù)將EC劃分為4種分子分型，即POLE（DNA聚合酶ε）突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型、低拷貝數(shù)型和高拷貝數(shù)型。該分子分型對(duì)預(yù)后判斷及精準(zhǔn)治療有重要意義，但也存在局限性[3，4]。在腫瘤精準(zhǔn)治療的背景下，探討基因突變的預(yù)后意義及作用機(jī)制，對(duì)靶向治療的靶點(diǎn)選擇具有重要參考意義。ASXL1（Additional sex combs like 1）基因首次于2009年在骨髓增生異常綜合征（MDS）中報(bào)道[5]，其位于染色體20q11，靠近DNMT3B基因[6]，由12個(gè)外顯子組成。根據(jù)既往研究，ASXL1基因突變?cè)谘合到y(tǒng)髓系腫瘤中是預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物[7]，包括骨髓增殖性腫瘤（MPN）、骨髓增生異常綜合征（MDS）、慢性粒單核細(xì)胞白血病（CMML）和急性髓系白血?。ˋML）等。然而，ASXL1在EC中的預(yù)后意義鮮有報(bào)道，其相關(guān)機(jī)制仍有待研究。本研究旨在通過多種腫瘤綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，分析ASXL1基因突變?cè)贓C患者中的預(yù)后意義及可能的作用機(jī)制，為EC的精準(zhǔn)治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與方法基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancerpku.cn/）分析ASXL1基因突變?cè)贓C患者中的預(yù)后意義及其與臨床分期的關(guān)系。同時(shí)，通過獲取在EC中與ASXL1有相似表達(dá)特征的前200個(gè)基因，對(duì)其信號(hào)通路相關(guān)性及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)做了進(jìn)一步分析。

基于Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（https://kmplot.com/analysis/），匯總ASXL1基因突變?cè)贓C患者中的預(yù)后意義，包括總生存期（Overall survival，OS）與無復(fù)發(fā)生存期（Relapse-free survival，RFS）。通過將ASXL1基因突變截分為高低兩組，比較兩組的生存差異，并進(jìn)一步計(jì)算危險(xiǎn)比（Hazard ratio，HR）、95%置信區(qū)間（95%CI）以及P值。

基于FireBrowse網(wǎng)站（http://www.firebrowse.org/），分析ASXL1的基因表達(dá)、DNA甲基化、拷貝數(shù)變異和突變狀態(tài)。同時(shí)，基于人類蛋白質(zhì)圖譜圖像分類數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Protein Atlas），ASXL1的組織、器官分布情況得以呈現(xiàn)，也對(duì)ASXL1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）作為在線檢索已知蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)直接或間接的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能分析?；赟TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，納入50個(gè)表達(dá)量相對(duì)較高的相關(guān)因素，結(jié)合Cytoscape軟件，進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析（Protein-protein interaction network，PPI）。納入分析的最小相關(guān)性分?jǐn)?shù)為0.400。

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu）是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站。分析ASXL1基因在不同種族、年齡、更年期狀態(tài)以及組織學(xué)亞型EC患者中的表達(dá)水平。

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）是基于Annotation Tool，GoCharts，KeggCharts以及Domain Charts四個(gè)分析模塊實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)基因組規(guī)模數(shù)據(jù)集的分析。通過其在線分析功能，對(duì)ASXL1基因突變密切相關(guān)的生物學(xué)過程以及富集的信號(hào)通路進(jìn)行初步探究。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC患者中ASXL1基因突變狀態(tài)及分布差異GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示ASXL1基因在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，其中在EC中表達(dá)降低，見圖1。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示ASXL1基因在不同種族、年齡、更年期狀態(tài)以及組織學(xué)類型中的分布差異。與正常組相比，年齡21～40歲組和41～60歲組中ASXL1基因水平有所降低（P＜0.001），各種族人群比較顯示高加索人群中EC患者ASXL1基因水平低于正常人群（P＜0.001），其余人種無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。絕經(jīng)前人群中EC患者ASXL1基因水平明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.001）。根據(jù)不同組織學(xué)亞型進(jìn)行分組，EC中ASXL1基因水平明顯降低，而漿液性癌與之相反（P＜0.001），見圖2。

圖1 不同腫瘤類型與正常對(duì)照組織中ASXL1基因的表達(dá)情況

圖2 ASXL1基因在不同年齡、組織學(xué)類型、更年期狀態(tài)以及種族間的分布差異

利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)追蹤ASXL1基因的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因主要定位于細(xì)胞的核質(zhì)和核仁。通過FireBrowse網(wǎng)站分析了538例EC患者的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)突變水平較高的基因主要包括PTEN、PIK3CA、ARID1A、PIK3R1、CTNNB1、TP53、KRAS等，其突變類型主要為無義突變和錯(cuò)義突變。

2.2 ASXL1基因突變?cè)贓C預(yù)后中的意義通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)log-rank法及生存曲線比較，顯示升高的ASXL1 mRNA水平與縮短的OS及RFS相關(guān)（P＜0.001）。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASXL1突變?cè)诓煌瑫r(shí)期腫瘤中存在差異，處于疾病進(jìn)展期（Ⅲ、Ⅳ期）的EC患者較疾病初期（Ⅰ、Ⅱ期）的患者有所升高，見圖3。

圖3 ASXL1基因表達(dá)水平與OS、RFS及腫瘤分期之間關(guān)系

2.3 EC患者中ASXL1基因的突變狀態(tài)及功能預(yù)測(cè)在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲取TCGA及GTEx測(cè)序數(shù)據(jù)中前200位與ASXL1有相似表達(dá)特征的基因，并通過Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)這些基因進(jìn)行排序。采用GO分析及KEGG分析對(duì)ASXL1突變相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析及信號(hào)通路預(yù)測(cè)。通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），發(fā)現(xiàn)與ASXL1突變密切相關(guān)的生物學(xué)過程主要包括DNA轉(zhuǎn)錄、RNA處理、RNA剪接等；蛋白質(zhì)結(jié)合、組蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子活性、序列特異性DNA結(jié)合等分子功能的改變與ASXL1基因突變有關(guān)；而核質(zhì)、驅(qū)動(dòng)蛋白復(fù)合物等細(xì)胞組分的改變與ASXL1基因異常表達(dá)有關(guān)。通過KEGG分析，這些相關(guān)基因突變主要與mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)。見圖4。

圖4 GO分析與ASXL1基因異常表達(dá)有關(guān)的生物學(xué)過程（左）、細(xì)胞組分（中）和分子功能（右）之間的關(guān)系

2.4 PPI及ASXL1基因的相關(guān)性分析選取前50位與ASXL1有相似表達(dá)情況的相關(guān)基因，通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）在線分析以及Cytoscape軟件的可視化繪圖，進(jìn)行了PPI分析。表觀遺傳學(xué)相關(guān)改變與ASXL1存在相互作用關(guān)系，包括HDAC2、DNMT3A、CBX家族以及TET2，見圖5。另外，在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過TCGA及GTEx的數(shù)據(jù)集對(duì)ASXL1突變存在密切關(guān)系的基因做相關(guān)性分析。ASXL1基因突變與PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3及TET2多個(gè)基因存在正相關(guān)，其中PTEN（r=0.55，P＜0.001）、PIK3CA（r=0.73，P＜0.001）、JAK2（r=0.66，P＜0.001）、STAT3（r=0.6，P＜0.001）以及TET2（r=0.63，P＜0.001），見圖6。

圖5 ASXL1與相似基因表達(dá)的蛋白質(zhì)互作圖

圖6 TET2、PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3基因與ASXL1表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

本研究顯示ASXL1在EC中存在基因突變。通過GEPIA和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變是EC的不良預(yù)后因素，與OS和RFS均存在相關(guān)。雖然ASXL1基因突變?cè)贓C中的預(yù)后價(jià)值極少報(bào)道，但從公共數(shù)據(jù)庫(kù)的大樣本分析看，該基因的突變狀態(tài)確實(shí)對(duì)生存造成了威脅。作為腫瘤抑制基因，ASXL1的缺失也是結(jié)直腸腫瘤（Colorectal cancer，CRC）中的不良預(yù)后因子[8]。有學(xué)者在結(jié)直腸樣本（408例結(jié)直腸癌、46例正常結(jié)腸粘膜、48例腺瘤及92例癌性淋巴結(jié)）中發(fā)現(xiàn)，ASXL1的缺失造成5年生存率明顯低于正常組（78.7%±2.5% vs 100%，P=0.034）。并且，在結(jié)直腸正常組織→腺瘤→腺癌→癌性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)展的過程中，ASXL1基因缺失的比例也逐漸增加[8]。這表明ASXL1作為抑癌基因的缺失狀態(tài)是腫瘤患者的不良預(yù)后因素，其可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，使得疾病更具侵襲性。在我們的分析中，ASXL1突變不僅是預(yù)后不良因素，且在疾病晚期的患者中突變率顯著升高。這提示在EC中ASXL1突變同樣與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，是評(píng)判臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。

ASXL1基因突變?nèi)绾伟l(fā)揮功能、影響預(yù)后，仍然缺乏可靠的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。通過GO分析及KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)ASXL1參與的生物學(xué)過程主要包括DNA轉(zhuǎn)錄、RNA處理、RNA剪接等。結(jié)合相關(guān)性分析可以發(fā)現(xiàn)ASXL1與PTEN、PIK3CA、JAK2及STAT3基因存在相關(guān)性，ASXL1可能與PI3K/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)。眾所周知，PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞周期。PI3K（The phosphatidylinositol 3-kinase）是一類高度保守的酶家族，是胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)軸的重要組成部分。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等方面都發(fā)揮著重要作用，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的很多成員分子，都是癌癥、免疫及控制血栓形成等過程中的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)[9]。PI3K激活磷酸化并激活A(yù)KT，使其定位在質(zhì)膜上。AKT可以具有許多下游效應(yīng)，如激活CREB，抑制p27，在細(xì)胞質(zhì)中定位FOXO，激活PtdIns-3ps和激活mTOR可能會(huì)影響p70或4EBP1的轉(zhuǎn)錄。而腫瘤抑制基因PTEN能夠通過去磷酸化而使PIP3變?yōu)镻IP2，是該通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[10]。在我們的分析中，ASXL1基因突變與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活相關(guān)，且與PTEN基因突變存在正相關(guān)性，表明兩者可能發(fā)揮了協(xié)同致病的效應(yīng)，共同導(dǎo)致疾病不良預(yù)后。

近年來，腫瘤的分子生物學(xué)檢測(cè)尤其是高通量測(cè)序，為精準(zhǔn)治療創(chuàng)造了必要條件[11～13]?；谖覀儗?duì)EC的腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，干預(yù)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能為患者治療帶來益處，尤其是對(duì)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的EC患者。PI3K存在4種異構(gòu)體，其信號(hào)協(xié)同有所差異，但最終與PTEN突變有重要關(guān)系，導(dǎo)致癌癥發(fā)生。PI3K下游存在兩條重要通路，其中FOXO主要與細(xì)胞分化有關(guān)，而mTORC主要與細(xì)胞增殖有關(guān)[14]。目前關(guān)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的靶向干預(yù)治療報(bào)道較多，包括單獨(dú)或聯(lián)合靶向PI3K異構(gòu)體以及靶向mTOR的藥物[15]。目前臨床可及的藥物包括PI3K抑制劑（Idelalisib、Infinity等）及mTOR抑制劑（雷帕霉素）。由于諸多惡性腫瘤中普遍存在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路異常，包括實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤[9]，故而以該通路為靶點(diǎn)研發(fā)腫瘤抑制劑也是研究熱點(diǎn)。但是，在其他實(shí)體腫瘤的研究中，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR單靶點(diǎn)抑制劑很難產(chǎn)生顯著、可持續(xù)的治療效應(yīng)，而聯(lián)合用藥成為重要的研究方向[16～18]。目前，探索PI3Kα/mTOR雙靶點(diǎn)藥物如NVP-BEZ235、PI3Kα/δ/γ/PDK1雙靶點(diǎn)抑制劑等，均在實(shí)體腫瘤及血液病研究中存在巨大潛力，可能有可觀的臨床療效，具備應(yīng)用前景[19]。

本研究通過腫瘤綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變與EC患者不良預(yù)后有關(guān)，是重要的臨床預(yù)后參考指標(biāo)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因突變狀態(tài)也有助于評(píng)估疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。同時(shí)，通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變可能與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)有關(guān)，這表明靶向該通路的抑制劑可能成為潛在有效的治療方式，尤其是對(duì)于復(fù)發(fā)/進(jìn)展的患者。不過本研究仍存在局限性：①本研究納入的人群為EC患者，來自于特定的國(guó)家和地區(qū)，可能缺乏種族特異性；②本研究通過公共數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析，缺乏嚴(yán)謹(jǐn)可靠的生物學(xué)驗(yàn)證，其真實(shí)性仍然值得進(jìn)一步研究；③基因測(cè)序的數(shù)據(jù)樣本量中等，在真實(shí)世界能否重現(xiàn)ASXL1突變的臨床預(yù)后意義，需要臨床隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，我們通過多個(gè)腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)ASXL1基因突變是EC患者的不良預(yù)后因素，顯著影響OS及RFS，且與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。靶向該通路可能成為新的治療選擇，為復(fù)發(fā)/進(jìn)展的EC患者帶來福音[20]，但需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳飳W(xué)驗(yàn)證以及前瞻性的臨床試驗(yàn)證實(shí)?？傊?，探索ASXL1基因突變的預(yù)后意義及作用機(jī)制，可能成為未來EC精準(zhǔn)治療的新研究方向。