Janus激酶2選擇性抑制劑HipHop藥效團(tuán)模型與3D QSAR模型的建立

梁 妍，陳小兵，黃麗蕓，袁章林，董開(kāi)心，劉燕華，鐘山裕，李豫園，許 軍*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004；2.贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，贛州 341000)

Janus激酶2(JAK2)是酪氨酸激酶(JAK)家族的4個(gè)激酶亞型之一，是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，廣泛分布于人體的各種組織細(xì)胞中[1]。JAK2可介導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)及生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，在人體正常造血功能中起到非常重要的作用[2-3]。研究表明，JAK-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(JAK-STAT)信號(hào)通路能快速將膜外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖生存、抑制凋亡，并在實(shí)體瘤、淋巴瘤腫瘤及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]，而JAK2-STAT信號(hào)通路的持續(xù)激活與人類多種腫瘤尤其是造血系統(tǒng)惡性腫瘤的形成有關(guān)，如慢性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤和急性髓性白血病等。JAK2抑制劑通過(guò)影響JAK2-STAT通路而降低一些炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子和化學(xué)因子從而影響其產(chǎn)物的調(diào)控達(dá)到臨床效果[6]。JAK2選擇性抑制劑可針對(duì)JAK2激酶特異區(qū)域選擇性結(jié)合到激酶催化區(qū)，從而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。目前，JAK2抑制劑主要應(yīng)用于骨髓增生性疾病與實(shí)體瘤的治療中，但其在臨床使用中出現(xiàn)了耐藥性、毒性和不良反應(yīng)等問(wèn)題，因此尋找新型、療效更強(qiáng)、不良反應(yīng)更小的JAK2選擇性抑制劑可為臨床應(yīng)用提供更多、更好的選擇。

藥效團(tuán)模型是一種基于配體的藥物設(shè)計(jì)工具，通過(guò)已有化合物的三維結(jié)構(gòu)信息構(gòu)建藥效團(tuán)模型是藥物發(fā)現(xiàn)的一種重要手段[7-8]?；诜肿庸餐卣魉幮F(tuán)(HipHop)模型用于發(fā)現(xiàn)一系列配體小分子所共有的化學(xué)特征，并基于這些共同特性結(jié)構(gòu)的比對(duì)疊合自動(dòng)生成藥效團(tuán)模型，其不僅可篩選具有潛在活性的化合物，而且可以使用共有的特征藥效團(tuán)搜索化合物數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)尋找可能的先導(dǎo)分子。

定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型試圖發(fā)現(xiàn)能夠同生物大分子靶標(biāo)在形狀和電荷(靜電勢(shì))上互補(bǔ)的小分子。QSAR模型是基于小分子的立體和靜電場(chǎng)構(gòu)建的回歸模型，可用于預(yù)測(cè)未知配體小分子的活性及觀察受體-配體間有利和不利的相互作用。與2D QSAR相比，3D QSAR更能間接反映配體小分子和蛋白大分子之間的非鍵相互作用特征，具有更加豐富的物理化學(xué)內(nèi)涵，因此得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

利用定性的HipHop藥效團(tuán)模型技術(shù)和定量的QSAR模型方法構(gòu)建JAK2選擇性抑制劑模型，旨在發(fā)現(xiàn)獲得可以篩選能力強(qiáng)且可以指導(dǎo)先導(dǎo)物改造的最優(yōu)模型，為JAK2選擇性抑制劑的研究提供參考。

1 HipHop藥效團(tuán)模型的建立

1.1材料與方法 通過(guò)Discovery Studido 4.5軟件中HipHop算法構(gòu)建JAK2選擇性抑制劑藥效團(tuán)模型。搜集大量已報(bào)道文獻(xiàn)中的活性JAK2抑制劑小分子，從中篩選出對(duì)JAK2激酶具有選擇性和共同特性結(jié)構(gòu)且活性較強(qiáng)的9個(gè)化合物作為訓(xùn)練集，27個(gè)化合物作為測(cè)試集[9-11]。測(cè)試集化合物包括活性和非活性小分子，20個(gè)非活性小分子來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)?；钚孕》肿?化合物1～27)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，其半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為0.6、0.8、0.9、1.4、1.4、0.7、1.1、1.3、1.8、3.0、5.6、1.5、8.0、1.0、1.3、1.8、1.0、31.9、3.2、3.2、15.5、7.1、9.7、2.0、5.0、2.0、9.0 nmol·L-1。

圖1 活性JAK2選擇性抑制劑(1～27)的分子結(jié)構(gòu)式

1.2化合物前處理 在Chem Draw軟件中將上述27個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)畫出，保存格式為MDL Molfile。首先利用Discovery Studido 4.5軟件的Prepare Ligands 模塊和 Full Minimization 模塊對(duì)化合物進(jìn)行處理，產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)、加立場(chǎng)CHARMm和能量最小化等。然后在表格瀏覽器中將訓(xùn)練集分子的 Principal 和 MaxOmitFeat屬性定義，Principal 屬性定義了分子的活性水平，MaxOmitFeat 屬性定義了每個(gè)分子中允許不與藥效團(tuán)模型匹配的特征元素的個(gè)數(shù)。如果所選取的分子有截然不同的藥效特征類型和尺寸，那么 Principal 和 MaxOmitFeat 屬性設(shè)置的不同對(duì)最終構(gòu)建的藥效團(tuán)模型影響較大。最后在Feature Mapping模塊中選擇要匹配的特征元素，包括氫鍵受體、氫鍵供體、疏水中心、正電離子中心、負(fù)電離子基團(tuán)和芳環(huán)基團(tuán)[12]。

1.3模型建立 在 Common Feature Pharmacophore Generation模塊中，展開(kāi)Conformation Generation參數(shù)組，在下拉列表中選擇BEST，將Maximum Conformation(構(gòu)象上限數(shù))設(shè)為200，意為對(duì)每個(gè)小分子產(chǎn)生最多200個(gè)構(gòu)象用以表征小分子的構(gòu)象空間；將Energy Threshold(能量閾值)設(shè)置為10，意為只有同最低能構(gòu)象的能量差值在能量閾值10 kcal·mol-1之內(nèi)的構(gòu)象被保留[13]；其他參數(shù)則為默認(rèn)值。點(diǎn)擊Run運(yùn)行作業(yè)，運(yùn)行時(shí)間大概需要5 min。作業(yè)完成后打開(kāi)Report 鏈接，從Summary 一欄可知，此次運(yùn)算一共產(chǎn)生了10個(gè)藥效團(tuán)，每個(gè)藥效團(tuán)的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。排名第1的藥效團(tuán)評(píng)分高于其他，因此選擇第1個(gè)藥效團(tuán)模型進(jìn)行后續(xù)工作。

表1 JAK2選擇性抑制劑HipHop模型結(jié)果的輸出參數(shù)

最優(yōu)藥效團(tuán)模型由5個(gè)特征元素構(gòu)成，分別為1個(gè)芳環(huán)中心(黃色)、2個(gè)疏水特征(藍(lán)色)、2個(gè)氫鍵受體特征(綠色)，最優(yōu)藥效團(tuán)模型空間排列方式見(jiàn)圖2A。根據(jù)評(píng)分值可知，化合物1與藥效團(tuán)的疊合效果最好，疊合效果見(jiàn)圖2B。

圖2 HipHop產(chǎn)生的最優(yōu)藥效團(tuán)模型(A)及其疊合結(jié)果(B，化合物1)

1.4測(cè)試集驗(yàn)證 展開(kāi)Conformation Generation參數(shù)組，點(diǎn)擊Conformation Generation右邊選項(xiàng)，選擇BEST模式，構(gòu)象上限數(shù)設(shè)為200，能量閾值設(shè)為10。運(yùn)行后，得到具有JAK2選擇性抑制作用的18個(gè)小分子全部命中，而非活性分子命中1個(gè)，說(shuō)明該模型具有較高的預(yù)測(cè)力和篩選能力。但是評(píng)分值代表該化合物結(jié)構(gòu)與藥效團(tuán)的匹配程度，并不等同于IC50值或半數(shù)抑制常數(shù)(Ki)值[14]。因此HipHop為定性藥效團(tuán)模型，在一定范圍內(nèi)可預(yù)測(cè)化合物是否具有活性，指導(dǎo)該藥物的研發(fā)，但不能給出準(zhǔn)確的活性數(shù)值。該模型具有一定的局限性，建立3D QSAR模型可以在其基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)該類化合物的活性，并對(duì)其化合物結(jié)構(gòu)的改造提供指導(dǎo)。

2 3D QSAR模型的建立

2.1材料與方法 通過(guò)Discovery Studido 4.5軟件中3D QSAR模塊構(gòu)建JAK2選擇性抑制劑的3D QSAR模型。訓(xùn)練集與測(cè)試集的活性小分子結(jié)構(gòu)與HipHop中的相反，3D QSAR訓(xùn)練集中去除了2個(gè)活性較弱的小分子。在構(gòu)建模型時(shí)，化合物活性數(shù)之間的差值一般在1～2之間效果最佳，因此活性數(shù)據(jù)一般轉(zhuǎn)換為lgIC50。本方法利用能量格點(diǎn)作為描述符構(gòu)建了一個(gè)偏最小二乘(PLS)模型，該能量格點(diǎn)由2種用于測(cè)量靜電勢(shì)和立體效應(yīng)的探針計(jì)算得到。

2.2化合物前處理 在Small Molecules模塊中的Minimize Ligands選中所有訓(xùn)練集化合物，批量對(duì)化合物進(jìn)行疊合能量?jī)?yōu)化，疊合效果決定了最終模型的可信度。見(jiàn)圖3。由圖3可知，訓(xùn)練集分子結(jié)構(gòu)疊合效果較好，有利于模型的建立。

圖3 訓(xùn)練集分子優(yōu)化疊合效果圖

2.3模型建立 打開(kāi)Creat QSAR Model模塊，將16個(gè)訓(xùn)練集小分子設(shè)置到參數(shù)表中的Input Ligands選項(xiàng)；將9個(gè)測(cè)試集小分子設(shè)置到參數(shù)表中的Input Test Ligands。Activity Property為arNCTRlogRBA，在Model Name欄中輸入 Grid Based Model，其余參數(shù)保留默認(rèn)設(shè)置。點(diǎn)擊Run運(yùn)行該作業(yè)，該作業(yè)大概需要運(yùn)行1 min。待作業(yè)完成后，在Report文件的Results部分，點(diǎn)擊View Results查看運(yùn)行結(jié)果。以訓(xùn)練集分子的實(shí)驗(yàn)活性值為橫坐標(biāo)(x1)、預(yù)測(cè)值為縱坐標(biāo)(y1)，訓(xùn)練集的多元線性回歸模型(MLR)線性回歸方程為y1=0.986x1+0.006。R12值越接近1，表示預(yù)測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚏12=0.986，即建立的該模型所預(yù)測(cè)的化合物lgIC50值與其真實(shí)值十分接近，說(shuō)明該模型成功建立。

2.4QSAR模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)能力，對(duì)所設(shè)置的測(cè)試集進(jìn)行外部驗(yàn)證。在Report窗口中，點(diǎn)擊View Test Results鏈接查看該模型對(duì)于測(cè)試集化合物活性值預(yù)測(cè)的可信度，以測(cè)試集分子的實(shí)驗(yàn)活性值為橫坐標(biāo)(x2)、預(yù)測(cè)值為縱坐標(biāo)(y2)，測(cè)試集MLR的線性回歸方程為y2=0.047x2+0.465，R22=0.273，表明該模型具有一定的可信度。

2.53D QSAR的3D格點(diǎn) 3D QSAR 模型除了預(yù)測(cè)能力，其相應(yīng)的3D格點(diǎn)圖也具有一定的作用。格點(diǎn)包含表征靜電勢(shì)和表征范德華作用兩部分內(nèi)容。在Report中，點(diǎn)擊View Training Set Aligned to ModelEP，視圖窗口中顯示了訓(xùn)練集分子匹配至3D QSAR模型的靜電場(chǎng)系數(shù)等，見(jiàn)圖4。紅色區(qū)域表示該區(qū)域取代基的負(fù)電性越強(qiáng)越有利于提高化合物的活性,如帶負(fù)電荷的原子，羧酸、亞磺酸中的羥基氧等；藍(lán)色區(qū)域表示該區(qū)域取代基的正電性越強(qiáng)越有利于提高化合物的活性，如帶正電荷的原子，伯、仲、叔脂肪胺中的氮原子等。

圖4 3D QSAR模型的靜電場(chǎng)系數(shù)等高圖(A)與立體場(chǎng)系數(shù)等高圖(B)

在Report中，點(diǎn)擊 View Training Set Aligned to ModelVDW，視圖窗口中顯示了訓(xùn)練集分子匹配至3D QSAR模型的立體場(chǎng)系數(shù)等高圖。黃色區(qū)域表示該區(qū)域取代基體積的增大不利于提高化合物的活性；綠色區(qū)域表示該區(qū)域取代基體積的增大有利于提高化合物的活性。例如化合物1、2、4、12等，隨著氨基位引入的取代基體積的增大，化合物活性不斷提高。因此對(duì)該類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)優(yōu)先引入體積較大的取代基團(tuán)，以期提高化合物的生物活性。

3 結(jié)論

將從已報(bào)道文獻(xiàn)中篩選出具有JAK2選擇性抑制作用強(qiáng)和共同特性結(jié)構(gòu)的化合物分別從定性及定量方面建立模型。根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果可知，HipHop藥效團(tuán)模型可預(yù)測(cè)化合物是否具有活性,且篩選能力較強(qiáng)，但不能預(yù)測(cè)化合物活性的強(qiáng)弱，存在一定的限制性，而3D QSAR模型可以補(bǔ)足此缺點(diǎn)，能夠預(yù)測(cè)該類化合物的活性值且對(duì)其結(jié)構(gòu)的修飾指明方向。因此，2個(gè)模型的結(jié)合有利于JAK2選擇性抑制的發(fā)現(xiàn)，為該類藥物的研究提供指導(dǎo)。