黃芪多糖通過線粒體自噬抑制肝癌腫瘤細(xì)胞

張慧蓉，錢 敏，李 萌

(1.淄博岜山萬杰醫(yī)院檢驗(yàn)科，淄博 255200；2.濟(jì)南市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250031;3.山東省立第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250031)

黃芪多糖(APS)是從中草藥黃芪Astragalusmongholicus中分離得到的，常作為免疫增強(qiáng)劑用于臨床[1]。APS具有許多生物學(xué)作用，對(duì)糖尿病、腫瘤等疾病的防治具有重要應(yīng)用價(jià)值，能有效調(diào)節(jié)肥胖大鼠血脂水平并改善胰島素抵抗，其機(jī)制可能是通過增加大鼠腓腸肌組織中的胰島素受體底物(IRS1)水平、降低胰島素受體底物(IRS1)307位絲氨酸磷酸化(Serine307)水平實(shí)現(xiàn)的[2]。APS可抑制胃癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[1]，還可通過下調(diào)Janus激酶信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用[3]。

自噬在生理和病理過程中起著廣泛作用，如饑餓適應(yīng)[4]、胚胎發(fā)育[5]、細(xì)胞存活和死亡[6]以及腫瘤抑制[7]。文獻(xiàn)報(bào)道[5]，在代謝應(yīng)激下，自噬既可抑制又可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，一方面，自噬可通過清除受損線粒體，使腫瘤細(xì)胞存活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展；另一方面，自噬還通過過度的自我消化和凋亡激活直接或間接誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡，抑制腫瘤進(jìn)展[5]。

在本研究中，使用肝癌細(xì)胞SMMC-7721評(píng)估APS能否抑制SMMC-7721增殖、能否刺激自噬以及是否涉及自噬。

1 材料

人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。APS 粉針劑(規(guī)格：250 mg·瓶-1)，天津賽諾制藥有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基，胰蛋白酶,Thermo Fisher公司；胎牛血清，Hyclone 公司；溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)試劑盒，姬姆薩染液，二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙錠(PI)，BCA 蛋白定量試劑盒，均購自上海碧云天生物公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴佛洛霉素A1(Baf)，均購自Sigma-Aldrich公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱(含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2)中保存。

2.2分組 APS低、中、高劑量組(質(zhì)量濃度分別為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1)以及對(duì)照組(只加生理鹽水)。

2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖 將細(xì)胞以3×102個(gè)·孔-1的密度接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，分別加入APS，使其終質(zhì)量濃度分別為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1，對(duì)照組僅加生理鹽水。每組設(shè)3個(gè)平行孔，孔內(nèi)液體終體積為500 μL。置于37 ℃的孵箱(體積分?jǐn)?shù)5%CO2)中孵育10 d。加甲醇300 μL，室溫固定15 min，姬姆薩染液染色20 min，空氣中干燥后計(jì)數(shù)[8]。

2.4MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以3×103個(gè)·孔-1的密度接種于96 孔板中，分別加入APS，使其終質(zhì)量濃度為0.75、1.50、3.00 mg·mL-1，對(duì)照組僅為培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)平行孔，孔內(nèi)液體終體積為200 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL 新配制的質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，用DMSO溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)[9-10]。

2.5細(xì)胞周期檢測(cè) 收集細(xì)胞后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇固定過夜。用PBS沖洗2次，加50 μg·mL-1PI染液，4 ℃避光反應(yīng) 30 min。用Beckman流式細(xì)胞儀收取細(xì)胞(每個(gè)樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞)。

2.6Western Blot 處理結(jié)束后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于50 g·L-1脫脂奶粉中封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST緩沖液室溫下沖洗后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。以β-actin作為參照。采用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)曝光采集圖片。最后使用NIH Image J 軟件進(jìn)行定量分析[11-12]。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)均使用SPSS 16.0軟件包。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過t檢驗(yàn)確定。本研究中的所有測(cè)試都是雙側(cè)的，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1APS抑制肝癌細(xì)胞平板克隆形成 結(jié)果表明，對(duì)照組以及APS低、中、高劑量組的SMMC-7721細(xì)胞克隆數(shù)分別為88.2±8.5、81.6±8.2、53.3±6.9、22.5±3.4。與對(duì)照組比較，APS可使SMMC-7721細(xì)胞克隆數(shù)減少，且其作用呈質(zhì)量濃度依賴性，APS高劑量組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯。以上結(jié)果提示APS可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖。

3.2APS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用 見表1。由表1可知，培養(yǎng)72 h后，APS可明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，其中APS高劑量組抑制作用最強(qiáng)，呈質(zhì)量濃度依賴性。

表1 APS抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用

3.3APS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響 見表2。由表2可知，與對(duì)照組比較，APS可使SMMC-7721細(xì)胞S期細(xì)胞比例減少，而G0/G1期細(xì)胞比例增加，以上結(jié)果提示APS可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖。

表2 APS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響 (n=6)

3.4APS對(duì)Beclin 1、微管相關(guān)輕鏈3B (LC3B)和p62等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖1和表3。結(jié)果表明，APS可顯著增加Beclin 1、LC3B和p62的蛋白表達(dá)，刺激線粒體自噬，且APS高劑量組抑制細(xì)胞增殖的作用更加明顯，因此選用APS高劑量組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Western Blot圖

表3 APS刺激LC3B、Beclin 1和p62等線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的Western Blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.5自噬介導(dǎo)APS刺激SMMC-7721細(xì)胞凋亡 應(yīng)用線粒體自噬抑制劑在不存在或存在3-MA和/或Baf的情況下，用不同質(zhì)量濃度的APS預(yù)處理SMMC-7721細(xì)胞，檢測(cè)APS的抑制作用，見表4。由表4可知，3-MA和Baf均能部分抑制APS引起的細(xì)胞凋亡。

表4 線粒體自噬抑制劑阻斷APS刺激SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用 (n=5)

4 討論

本課題組對(duì)APS能否抑制肝癌細(xì)胞增殖、作用是否涉及線粒體自噬進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APS可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，還可顯著刺激自噬，且其抑制作用可被線粒體自噬抑制劑抑制。以上結(jié)果表明，APS可通過線粒體自噬抑制SMMC-7721細(xì)胞。

肝癌在臨床上病情進(jìn)展速度快、預(yù)后較差[3]。中藥提取物APS具有增強(qiáng)免疫的作用，安全性良好。Zhou L等[13]研究發(fā)現(xiàn)，APS可調(diào)節(jié)宿主機(jī)體免疫，其機(jī)制涉及Toll 樣受體 4(TLR4) 介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路的激活。此外，APS還可抑制肝癌細(xì)胞 H22 實(shí)體瘤的形成，且與阿霉素具有協(xié)同抗腫瘤的作用[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APS可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，其作用呈質(zhì)量濃度依賴性。

自噬是特異性地降解細(xì)胞內(nèi)老化蛋白質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的過程，包括隔離、運(yùn)輸?shù)饺苊阁w、降解和降解產(chǎn)物的利用[15]，其特征是出現(xiàn)雙膜和多膜細(xì)胞質(zhì)小泡，吞噬細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，形成以微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)[16]為標(biāo)志的自噬體。許多關(guān)鍵分子參與了這一生物過程，酵母自噬蛋白6(Atg6)又稱膜泡分揀蛋白30(Vps30)，是Beclin 1的哺乳動(dòng)物同源物，研究表明，它可通過介導(dǎo)其他自噬蛋白在自噬前膜上的定位來促進(jìn)自噬體形成，因此是一種重要的調(diào)節(jié)器[17]。線粒體自噬在腫瘤中也是重要的信號(hào)通路[18]。本研究結(jié)果表明，APS 可顯著抑制肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞的增殖和活性，最佳質(zhì)量濃度為3.00 mg·mL-1，且該質(zhì)量濃度的APS可顯著刺激LC3B、Beclin 1和p62等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)APS是否通過激活自噬起到抑制腫瘤的作用，本課題組用自噬信號(hào)通路抑制劑3-MA和Baf預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬受到抑制后，APS的腫瘤抑制作用顯著減弱，因此其腫瘤抑制作用可能涉及自噬的激活。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，APS可抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的增殖和活性，其作用機(jī)制由自噬介導(dǎo)。